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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】如何克隆未知序列的β-actin 的启动子已有5人参与

我的目的是克隆头足类(我的研究对象就是一种乌贼)的β-actin 的启动子,构建表达性强的重组载体质粒。
    目前能查到很多的物种的β-actin 的启动子的序列,但是保守性不行,而且没有头足类的相应序列。所以我认为无法用简单的PCR操作来设计引物并克隆该启动子。
    各位大侠给我指点一二啊。要么克隆β-actin 的启动子,要么更换更好的更易获取的启动子。谢谢大家帮助啦
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab(金币+1):鼓励新虫!欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-19 00:08
以前听说过染色体步移法可以获得启动子序列,但是怎么做不知道,提供一个思路,楼主去查查,看看可不可行
2楼2010-04-18 21:25:26
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
这个有一定风险,有可能很好做有可能很不好做,需要看运气:
常用Tail-pcr,这个需要你根据已知序列(这里用β-actin基因的序列)设计特异性引物,并设计随机引物;
另外就是genome walking了,需要adaptor和几种内切酶以及设计特异性引物,有试剂盒;
通常要拿到promoter全序列可能要做好几轮。
你看看这篇文章吧,有用的:
http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=8859597hpvv5u4pvtb9bkho
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-04-19 12:52:35
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gastrodia

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你先用兼并引物PCR把β-actin 的序列搞出来,然后tailPCR或者waliking出上游区域,能搞出3k左右的序列基本启动子就全了,β-actin变异不大应该很容易克隆的
4楼2010-04-19 13:47:00
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月月大可

木虫 (著名写手)


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先搞定β-actin 的序列,然后买个walking的试剂盒,向上游走。拿到上游的序列后要鉴定启动子的核心区域是一件麻烦的工作。
5楼2010-04-19 16:42:22
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feiye2214

木虫 (正式写手)

walking试剂盒是用来tailPCR的么?那确定启动子核心区域没有什么通用的方法不?主要麻烦在什么地方?
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-04-19 16:42:22:
先搞定β-actin 的序列,然后买个walking的试剂盒,向上游走。拿到上游的序列后要鉴定启动子的核心区域是一件麻烦的工作。

6楼2010-04-19 17:54:15
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gastrodia

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
启动子预测有在线程序,用不同长度的启动子连接报告基因转化模式生物,通过测定报告基因产物所在的位置,报告产物的量,来判断是组成型表达还是组织特异性表达,表达强度如何,和其他的启动子比较一下
7楼2010-04-19 22:19:22
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