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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于连接转化
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塞外雨

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】关于连接转化 已有7人参与

请问连接转化，热击转化大肠和电转阳性菌，总是得不到转化子。
在连接转化方面，有什么经验，请教教我吧！多谢谢了
使用SalI和Nhe I 双酶切，质粒是约6800，目的片段约700.使用宝生物的solutionⅠ连接

[ Last edited by 塞外雨 on 2010-4-19 at 09:07 ]
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
1楼 2010-04-18 17:20:12
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
具体说说你用的什么载体，多大的片段，如何酶切连接的
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2楼2010-04-18 17:55:13
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个实在没什么好说的，仔仔细细地阅读protocol，记得我手把手教别人做大肠杆菌转化，最后我做出来了，她却没做出来，咋办，究其原因就是看的不仔细，
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3楼2010-04-18 23:05:55
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塞外雨

金虫 (著名写手)
谢谢各位
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
4楼2010-04-19 10:56:55
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 塞外雨 at 2010-04-18 17:20:12:
请问连接转化，热击转化大肠和电转阳性菌，总是得不到转化子。
在连接转化方面，有什么经验，请教教我吧！多谢谢了
使用SalI和Nhe I 双酶切，质粒是约6800，目的片段约700.使用宝生物的solutionⅠ连接

[ La ...

很可能就是链接出了问题。多优化条件吧。
你的感受态一般都没有问题的。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
5楼2010-04-19 11:41:29
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同意连接出了问题：
1，首先分析会不会双酶切有切不开的,引物上酶切位点的的保护碱基够不够
2，连接时一般要求质粒：片段>3
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-04-19 11:55:36
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塞外雨

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2010-04-19 11:41:29:

很可能就是链接出了问题。多优化条件吧。
你的感受态一般都没有问题的。

感受态没问题，因为PCR产物和T载体连接转化很好，就是双酶切后往目的质粒上连的时候，没有转化子，估计是没连上。
需要优化哪些条件呢？
谢谢
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
7楼2010-04-19 12:16:40
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塞外雨

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-04-19 11:55:36:
同意连接出了问题：
1，首先分析会不会双酶切有切不开的,引物上酶切位点的的保护碱基够不够
2，连接时一般要求质粒：片段>3

我是连到T载体之后再双酶切回收的，双酶切没有问题。
谢谢！
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
8楼2010-04-19 12:17:56
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liyong1981

金虫 (正式写手)
比例很重要
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9楼2010-04-19 13:42:31
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塞外雨

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-19 13:42:31:
比例很重要

如何确定比例，有什么规律吗？谢谢！
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
10楼2010-04-19 13:44:09
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