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塞外雨

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】关于连接转化已有7人参与

请问连接转化,热击转化大肠和电转阳性菌,总是得不到转化子。
在连接转化方面,有什么经验,请教教我吧!多谢谢了
使用SalI和Nhe I 双酶切,质粒是约6800,目的片段约700.使用宝生物的solutionⅠ连接

[ Last edited by 塞外雨 on 2010-4-19 at 09:07 ]
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
具体说说你用的什么载体,多大的片段,如何酶切连接的
2楼2010-04-18 17:55:13
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gastrodia

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
这个实在没什么好说的,仔仔细细地阅读protocol,记得我手把手教别人做大肠杆菌转化,最后我做出来了,她却没做出来,咋办,究其原因就是看的不仔细,
3楼2010-04-18 23:05:55
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塞外雨

金虫 (著名写手)

谢谢各位
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
4楼2010-04-19 10:56:55
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 塞外雨 at 2010-04-18 17:20:12:
请问连接转化,热击转化大肠和电转阳性菌,总是得不到转化子。
在连接转化方面,有什么经验,请教教我吧!多谢谢了
使用SalI和Nhe I 双酶切,质粒是约6800,目的片段约700.使用宝生物的solutionⅠ连接

[ La ...

很可能就是链接出了问题。多优化条件吧。
你的感受态一般都没有问题的。
【我一直认为做土匪很性感很坏,很直接,可以大声喊:JCMM我爱你!所以,我自从博士毕业后,就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
5楼2010-04-19 11:41:29
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
同意连接出了问题:
1,首先分析会不会双酶切有切不开的,引物上酶切位点的的保护碱基够不够
2,连接时一般要求质粒:片段>3
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-04-19 11:55:36
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2010-04-19 11:41:29:

很可能就是链接出了问题。多优化条件吧。
你的感受态一般都没有问题的。

感受态没问题,因为PCR产物和T载体连接转化很好,就是双酶切后往目的质粒上连的时候,没有转化子,估计是没连上。
需要优化哪些条件呢?
谢谢
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
7楼2010-04-19 12:16:40
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-04-19 11:55:36:
同意连接出了问题:
1,首先分析会不会双酶切有切不开的,引物上酶切位点的的保护碱基够不够
2,连接时一般要求质粒:片段>3

我是连到T载体之后再双酶切回收的,双酶切没有问题。
谢谢!
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
8楼2010-04-19 12:17:56
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liyong1981

金虫 (正式写手)


比例很重要
9楼2010-04-19 13:42:31
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-19 13:42:31:
比例很重要

如何确定比例,有什么规律吗?谢谢!
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
10楼2010-04-19 13:44:09
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