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塞外雨

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】关于连接转化已有7人参与

请问连接转化,热击转化大肠和电转阳性菌,总是得不到转化子。
在连接转化方面,有什么经验,请教教我吧!多谢谢了
使用SalI和Nhe I 双酶切,质粒是约6800,目的片段约700.使用宝生物的solutionⅠ连接

[ Last edited by 塞外雨 on 2010-4-19 at 09:07 ]
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
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塞外雨

金虫 (著名写手)

谢谢各位
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
4楼2010-04-19 10:56:55
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2010-04-19 11:41:29:

很可能就是链接出了问题。多优化条件吧。
你的感受态一般都没有问题的。

感受态没问题,因为PCR产物和T载体连接转化很好,就是双酶切后往目的质粒上连的时候,没有转化子,估计是没连上。
需要优化哪些条件呢?
谢谢
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
7楼2010-04-19 12:16:40
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-04-19 11:55:36:
同意连接出了问题:
1,首先分析会不会双酶切有切不开的,引物上酶切位点的的保护碱基够不够
2,连接时一般要求质粒:片段>3

我是连到T载体之后再双酶切回收的,双酶切没有问题。
谢谢!
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
8楼2010-04-19 12:17:56
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-19 13:42:31:
比例很重要

如何确定比例,有什么规律吗?谢谢!
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
10楼2010-04-19 13:44:09
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塞外雨

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-04-19 13:51:02:
点MARKER确定载体和片段大概的量。然后算出摩尔比。一般载体:片段在1:2-1:10都可以的。

谢谢今天调整了比例,重新连接转化了,谢谢。
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
12楼2010-04-19 13:53:05
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