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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR引物设计求助！！！
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR引物设计求助！！！ 已有5人参与

公司合成的2条引物 第一条 22BP  TM:51  第二条 53BP  TM：69
第一条引物我在PP5上测定时 TM是61.3
想进行PCR程序设定，不知道该怎么设定退火温度？谢谢！
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1楼 2010-04-18 11:21:21
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klosexs1987

金虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1): 2010-04-18 14:24
两条引物的解连温度相差太大了。。一般设计的两条引物解连温度相差应小于5度。。建议重新设计。。
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2楼2010-04-18 12:55:49
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
amisking(金币+1): 2010-04-18 13:07
第二条引物怎么会这么长？有问题吧 。
如楼上所说，退火温度差距也太大了，最好是上下不超过两度
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3楼2010-04-18 12:57:33
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cato8163

银虫 (正式写手)
做个梯度吧，在60度，上下10度。
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4楼2010-04-18 12:58:41
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2): 2010-04-18 20:42
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-18 12:57:33:
第二条引物怎么会这么长？有问题吧 。
如楼上所说，退火温度差距也太大了，最好是上下不超过两度

第二条引物之所以长是因为，我想通过PCR的方式在原有片段上延伸一段
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5楼2010-04-18 14:40:39
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by cato8163 at 2010-04-18 12:58:41:
做个梯度吧，在60度，上下10度。

能具体点吗？还有就是TM值是根据公司给的还是PP5上的呢？谢谢！
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6楼2010-04-18 14:41:26
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-18 12:57:33:
第二条引物怎么会这么长？有问题吧 。
如楼上所说，退火温度差距也太大了，最好是上下不超过两度

第二条引物之所以长是因为，我想通过PCR的方式在原有片段上延伸一段，不重新设计可以么？
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7楼2010-04-18 14:41:54
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rkrl001

木虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1):欢迎交流~~ 2010-04-18 18:54
建议重新设计引物，引物长度一般不超过25bp,Tm值相差一般在5度以内。
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8楼2010-04-18 14:44:21
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
如果不重新设计引物，我该怎么确定TM值呢？
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9楼2010-04-18 15:08:10
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
jiangkuo0520(金币+1): 2010-04-18 20:51
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-19 00:06
引用回帖:
Originally posted by jiangkuo0520 at 2010-04-18 14:41:54:

第二条引物之所以长是因为，我想通过PCR的方式在原有片段上延伸一段，不重新设计可以么？

什么意思，是说实际互补的并没有53bp，后面是长出来一段单链吗？
如果是这样，那么退火温度是根据互补的这一段算出来的吗？

反正勉强试试吧，也许能跑出来，不行再设计嘛，做个梯度，或者touch down一下
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10楼2010-04-18 18:00:56
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