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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于电转
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漫迹

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于电转 已有5人参与

我最近做一阴性菌的电击转化，一直没转进去，平板都是电转三天后才长出来好多菌落，提不出质粒，认为可能是抗生素失效的原因，对于电转有如下几个问题需要向各位请教：
1） 文献里一般的点击电压为1.5-2.4KV之间，我试过1.5、1.8、2.0、2.5KV电压下，25uF,200-400之间不同欧姆，都没有结果，不知道是为什么，我不是要提高转化效率，只是转进去就行了，现在很困惑
2） 电转可以从质粒上进行优化么，例如线性化或者加热or冰浴？
3） 做电转感受态，一般用的是10%的甘油，有的好像要加盐离子如MgCl2,CaCl2等，这些加的都是二价的，我查的文献里，有的要加0.85%的NaCl，有的不要，我试着加过一次，爆杯现象很严重（不知道是不是我加的量不是很精确，不过我想应该不会），想问问一价离子和二价离子区别大么，如果不加对转化效率影响大不大
    有哪位做过的帮帮我吧，不胜感激
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1楼 2010-04-17 22:11:14
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-18 01:43
漫迹(金币+1): 2010-04-18 10:20
1：一般是2300V（我们是这样）
2:可以将质粒的量提高！
3：我们用的是SOC
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2010-04-17 23:58:54
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匿名

用户注销 (著名写手)
★ ★
漫迹(金币+1): 2010-04-18 10:20
amisking(金币+2): 2010-04-18 13:07
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3楼2010-04-18 05:28:22
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j2

木虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1): 2010-04-18 14:28
同样电转化失败ing~~~~
电转化还是少点盐离子比较好，会爆，也会影响转化
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2010-04-18 09:56:05
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漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-04-17 23:58:54:
1：一般是2300V（我们是这样）
2:可以将质粒的量提高！
3：我们用的是SOC

请问你用的SOC 是复苏培养基还是感受态制备时的缓冲液，能分享下配方么，谢了
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5楼2010-04-18 10:21:59
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漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 彬心玉壶 at 2010-04-18 05:28:22:
最近做一阴性菌的电击转化

这里的阴性菌不是大肠杆菌吧，我觉得条件你只要按照一般的程序做，不要求转化率，只要求转化进去的话，那些条件都不是问题。

如果不是大肠杆菌，我觉得可能是感受态没有做好。

...

谢谢你的建议，我是连接好转在大肠DH5a里的，电转用的质粒是用天根中提试剂盒从大肠里提的，每次190ul感受态中加入10ul的质粒，我觉得不是质粒的问题，要是做对照，不知道该用什么质粒做呢
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6楼2010-04-18 10:24:28
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
漫迹(金币+1): 2010-04-18 14:02
电转时不加盐，加盐的话基本上全爆杯，直接用10%甘油洗三次，如果电转质粒的话一般用2500V，100ul感受态细胞加1ui质粒，效率非常高，复苏我们用过LB和SOC，感觉还是SOC好些。
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7楼2010-04-18 11:38:59
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漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yuanfeng at 2010-04-18 11:38:59:
电转时不加盐，加盐的话基本上全爆杯，直接用10%甘油洗三次，如果电转质粒的话一般用2500V，100ul感受态细胞加1ui质粒，效率非常高，复苏我们用过LB和SOC，感觉还是SOC好些。

问下电转脉冲时间是多长为最好，5-10ms行么，我做电转涂布三四天后，板上就会张满满一板的菌落，提过质粒什么也没有，是不是可以分析为抗生素失效呢，我用的是四环素
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8楼2010-04-19 10:14:23
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匿名

用户注销 (著名写手)
漫迹(金币+1): 2010-04-21 10:00
漫迹(金币+1): 2010-04-28 11:09
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9楼2010-04-20 17:35:00
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匿名

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10楼2010-04-20 17:36:35
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