应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒连接问题
81/1返回列表
查看: 686  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate

[交流] 【求助/交流】质粒连接问题 已有4人参与

求大大们：质粒连接的原理是什么啊？如果需要内切酶切开DNA，切开质粒的还好理解，但是要把目的片段的切开，再连接到质粒上，就不好理解了。那样岂不是把目的片段破坏了？还怎么测序什么的啊？而且，连接上目的片段的质粒也不能回复为环状，怎么进入到感受态细胞呢？
PS：我转化好的产物因为有多余，所以放在4度保存，大概3天了，会不会失效呢？
回复此楼

» 猜你喜欢
不忘初心，为梦远行。
1楼 2010-04-17 11:47:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 2010-04-17 13:31
目的片段经PCR后两端已经连接上酶切位点的，所以酶切但时候切的是两端，不会破坏片段本身，目的片段和质粒的链接也是通过酶切位点的粘性末端链接的，会成环状的
放在4度3天应该还能用，但是建议放在-20，如果长期不用的话~
赞一下(2人) 回复此楼
坚持能无数次改变人生的风景，因为只要路是对的，就不怕远~~~
2楼2010-04-17 12:21:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2010-04-17 12:21:02:
目的片段经PCR后两端已经连接上酶切位点的，所以酶切但时候切的是两端，不会破坏片段本身，目的片段和质粒的链接也是通过酶切位点的粘性末端链接的，会成环状的
放在4度3天应该还能用，但是建议放在-20，如果长期 ...

多谢！不过，目的片段是怎么通过PCR连上酶切位点的？它的两端不是引物吗？这么巧合每对引物都会有粘性末端吗？
赞一下 回复此楼
不忘初心，为梦远行。
3楼2010-04-17 16:33:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

entomology557

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1): 2010-04-17 18:13
lstt09nk(金币+2): 2010-04-17 19:06
引用回帖:
Originally posted by leon198418029 at 2010-04-17 16:33:02:


多谢！不过，目的片段是怎么通过PCR连上酶切位点的？它的两端不是引物吗？这么巧合每对引物都会有粘性末端吗？

一般设计引物的时候就需要考虑加上酶切位点，需要注意的是目的片段内部不能还有同样的酶切位点，不然就乱切了
赞一下(3人) 回复此楼
生物进化基本常识：一定范围内，选择压力越大，要么进化的越快来适应这种压力，或者直接被淘汰。
4楼2010-04-17 17:02:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
★ ★
lstt09nk(金币+2):万事开头难，加油~~ 2010-04-17 19:11
引用回帖:
Originally posted by entomology557 at 2010-04-17 17:02:21:


一般设计引物的时候就需要考虑加上酶切位点，需要注意的是目的片段内部不能还有同样的酶切位点，不然就乱切了

我连接用的是T-vector。刚刚研究了一下，理论上使用T-vector是可以连接所有PCR产物的，所以设计引物时不需要考虑酶切位点。不过设计时合理加入酶切位点会更好一些。
谢谢你关于目的片段内部酶切位点的提醒。在茫茫“碱基海”中考虑和寻找酶切位点，真是很累啊。
赞一下(1人) 回复此楼
不忘初心，为梦远行。
5楼2010-04-17 17:14:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by leon198418029 at 2010-04-17 17:14:17:


我连接用的是T-vector。刚刚研究了一下，理论上使用T-vector是可以连接所有PCR产物的，所以设计引物时不需要考虑酶切位点。不过设计时合理加入酶切位点会更好一些。
谢谢你关于目的片段内部酶切位点的提醒。 ...

推荐你使用引物设计软件或者用DNAMAN，里面能查找出目的片段内的酶切位点和未酶切位点，这样引物设计起来就方便多了~~
赞一下(1人) 回复此楼
坚持能无数次改变人生的风景，因为只要路是对的，就不怕远~~~
6楼2010-04-17 19:10:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2010-04-17 19:10:25:



推荐你使用引物设计软件或者用DNAMAN，里面能查找出目的片段内的酶切位点和未酶切位点，这样引物设计起来就方便多了~~

哦了！太感谢了！
回复此楼
不忘初心，为梦远行。
7楼2010-04-18 10:15:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
可以通过引物设计在目的片段两端加上内切酶切割位点，然后PCR扩增出片段，内切酶切，与同样内切酶切割回收的载体片段连接就OK了！
赞一下 回复此楼
大家共同交流、共同提高！！！
8楼2010-04-18 15:53:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 leon198418029 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 346，工科求调剂 +3 moser233 2026-04-09 3/150 2026-04-11 10:04 by zhq0425
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-04-05 11/550 2026-04-10 09:32 by 钟洲2011
[考研] 085601初试330分找调剂 +10 流心奶黄包l 2026-04-09 10/500 2026-04-10 08:14 by Sammy2
[考研] 085404，285分求调剂 +12 薇薇考研 2026-04-07 14/700 2026-04-09 23:10 by parmtree
[考研] 材料专硕调剂 +16 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-07 17/850 2026-04-09 21:16 by wutongshun
[考研] 材料299专硕求调剂 +10 +21 2026-04-09 10/500 2026-04-09 17:34 by 1753564080
[考研] 0860004 求调剂 309分 +6 Yin DY 2026-04-09 6/300 2026-04-09 10:19 by 啊李999
[考研] 318求调剂 +13 ykyhsa 2026-04-05 15/750 2026-04-08 21:37 by wj165256
[考研] 求调剂，现在还能填的 +3 上岸小莹加油 2026-04-08 3/150 2026-04-08 14:30 by zhq0425
[考研] 22408 266求调剂 +11 masss11222 2026-04-07 14/700 2026-04-08 11:06 by yulian1987
[考研] 调剂求助（生物与医药） +6 @6952 2026-04-06 6/300 2026-04-07 23:52 by lys0704
[考研] 323求调剂 +3 林zlu 2026-04-07 4/200 2026-04-07 23:21 by lbsjt
[考研] 307求调剂 +3 Youth@@ 2026-04-07 3/150 2026-04-07 22:00 by hemengdong
[考研] 312求调剂 +18 gtw1 2026-04-06 20/1000 2026-04-07 18:16 by 蓝云思雨
[考研] 生物调剂 +5 橙子橙子橙子啊 2026-04-05 9/450 2026-04-07 15:31 by 上岸快快
[考研] 319分085702安全工程求调剂 +6 rious 2026-04-05 6/300 2026-04-07 09:42 by jp9609
[考研] 22408 331分求调剂 +4 y__1 2026-04-06 4/200 2026-04-06 17:26 by 土木硕士招生
[考研] 22408 总分320，一篇论文二作，两个国三，求调剂 +3 Leomulufu 2026-04-04 5/250 2026-04-05 19:04 by chongya
[考研] 考研调剂生寻找导师 +3 顾瞻考研啊 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:18 by 啵啵啵0119
[考研] 313求调剂 +5 海日海日 2026-04-04 5/250 2026-04-05 15:52 by jndximd
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭