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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒连接问题
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate

[交流] 【求助/交流】质粒连接问题 已有4人参与

求大大们：质粒连接的原理是什么啊？如果需要内切酶切开DNA，切开质粒的还好理解，但是要把目的片段的切开，再连接到质粒上，就不好理解了。那样岂不是把目的片段破坏了？还怎么测序什么的啊？而且，连接上目的片段的质粒也不能回复为环状，怎么进入到感受态细胞呢？
PS：我转化好的产物因为有多余，所以放在4度保存，大概3天了，会不会失效呢？
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不忘初心，为梦远行。
1楼 2010-04-17 11:47:16
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂
★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 2010-04-17 13:31
目的片段经PCR后两端已经连接上酶切位点的，所以酶切但时候切的是两端，不会破坏片段本身，目的片段和质粒的链接也是通过酶切位点的粘性末端链接的，会成环状的
放在4度3天应该还能用，但是建议放在-20，如果长期不用的话~
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坚持能无数次改变人生的风景，因为只要路是对的，就不怕远~~~
2楼2010-04-17 12:21:02
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2010-04-17 12:21:02:
目的片段经PCR后两端已经连接上酶切位点的，所以酶切但时候切的是两端，不会破坏片段本身，目的片段和质粒的链接也是通过酶切位点的粘性末端链接的，会成环状的
放在4度3天应该还能用，但是建议放在-20，如果长期 ...

多谢！不过，目的片段是怎么通过PCR连上酶切位点的？它的两端不是引物吗？这么巧合每对引物都会有粘性末端吗？
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不忘初心，为梦远行。
3楼2010-04-17 16:33:02
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entomology557

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-04-17 18:13
lstt09nk(金币+2): 2010-04-17 19:06
引用回帖:
Originally posted by leon198418029 at 2010-04-17 16:33:02:


多谢！不过，目的片段是怎么通过PCR连上酶切位点的？它的两端不是引物吗？这么巧合每对引物都会有粘性末端吗？

一般设计引物的时候就需要考虑加上酶切位点，需要注意的是目的片段内部不能还有同样的酶切位点，不然就乱切了
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生物进化基本常识：一定范围内，选择压力越大，要么进化的越快来适应这种压力，或者直接被淘汰。
4楼2010-04-17 17:02:21
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
★ ★
lstt09nk(金币+2):万事开头难，加油~~ 2010-04-17 19:11
引用回帖:
Originally posted by entomology557 at 2010-04-17 17:02:21:


一般设计引物的时候就需要考虑加上酶切位点，需要注意的是目的片段内部不能还有同样的酶切位点，不然就乱切了

我连接用的是T-vector。刚刚研究了一下，理论上使用T-vector是可以连接所有PCR产物的，所以设计引物时不需要考虑酶切位点。不过设计时合理加入酶切位点会更好一些。
谢谢你关于目的片段内部酶切位点的提醒。在茫茫“碱基海”中考虑和寻找酶切位点，真是很累啊。
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不忘初心，为梦远行。
5楼2010-04-17 17:14:17
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lstt09nk

铁杆木虫 (职业作家)

小堂
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by leon198418029 at 2010-04-17 17:14:17:


我连接用的是T-vector。刚刚研究了一下，理论上使用T-vector是可以连接所有PCR产物的，所以设计引物时不需要考虑酶切位点。不过设计时合理加入酶切位点会更好一些。
谢谢你关于目的片段内部酶切位点的提醒。 ...

推荐你使用引物设计软件或者用DNAMAN，里面能查找出目的片段内的酶切位点和未酶切位点，这样引物设计起来就方便多了~~
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坚持能无数次改变人生的风景，因为只要路是对的，就不怕远~~~
6楼2010-04-17 19:10:25
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2010-04-17 19:10:25:



推荐你使用引物设计软件或者用DNAMAN，里面能查找出目的片段内的酶切位点和未酶切位点，这样引物设计起来就方便多了~~

哦了！太感谢了！
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不忘初心，为梦远行。
7楼2010-04-18 10:15:54
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
可以通过引物设计在目的片段两端加上内切酶切割位点，然后PCR扩增出片段，内切酶切，与同样内切酶切割回收的载体片段连接就OK了！
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大家共同交流、共同提高！！！
8楼2010-04-18 15:53:09
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