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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RNA提不出来，万分火急！
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谁知道

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RNA提不出来，万分火急！ 已有11人参与

大家好，最近一直在用Trizol法提取大肠杆菌总RNA，前几次提取的结果跑电泳只有一条带，应该是5S，特别亮。最近几次在提取过程中将步骤中需要涡旋震荡的均改为轻轻的颠倒混匀，结果有所改善，电泳图上能看到三条带，但23S和16S很弱，5S还是特别亮。如果提的好的话，应该是23S最亮，是16S的2倍亮度，而5S最弱。这应该是降解了吧，可该注意的事项都注意了，还是不行。哎，很着急啊，总RNA提不出来，实验就没法进行。大家多提宝贵意见啊！期待回复。我的操作步骤及电泳图如下：
过夜培养的E.coli O157: H7菌株，1: 100接种于LB培养液，37℃，200rpm振摇培养5h。
取1mL菌液，离心之后，倾出上清，将沉淀的菌体重悬浮于1ml Trizol，混匀，室温孵育5min。
加200μl氯仿，手动振摇15s混匀，室温孵育2~3min后，12000×g，15min，4℃离心。
从上层液中转移出400~600μl无色水相至新离心管中，加异丙醇约500μl，颠倒混匀以沉淀RNA，室温孵育10min后，15000×g，10min，4℃离心。
小心倾去上清，用1ml 75%乙醇重悬浮沉淀，颠倒混匀，7500×g，5min，4℃离心。
倾出上清，风干RNA沉淀，用40μl无RNase水重悬浮RNA沉淀。
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每个人一辈子从来都是一个人
1楼 2010-04-16 20:14:07
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zhongy1985

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主不要灰心！我有个同学也是提RNA，都提了大半年才有的结果！
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2楼2010-04-16 21:06:45
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主都万分火急了，就买个盒子吧，现在也便宜
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3楼2010-04-16 23:13:11
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谁知道

铁虫 (小有名气)
关键问题是现在的盒子都得过柱，只能提大于200nt的RNA，我主要关心的是细菌的小RNA，即50-400nt的。
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每个人一辈子从来都是一个人
4楼2010-04-17 11:36:02
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zhongjue

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
提RNA 好难哦，步步都不简单，也不定哪不就出点小偏差！
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5楼2010-04-19 15:21:34
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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lstt09nk(金币+1): 2010-04-21 18:16
步骤没什么问题，考虑是不是没有用RNase free的耗材。买进口的那种
另外就是是不是速度太慢了暴露在空气中的时间太长
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6楼2010-04-19 15:29:38
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石头8832

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1): 2010-04-21 18:16
你的耗材是怎么处理的，一定要用DEPC处理一下再用，如果不想处理的话，120度连续灭菌40min或者连续灭菌两次也可以，灭过菌以后烘箱内烘干后使用，效果也很好。其他的勤换手套，戴口罩等一些细节性的东西你就要自己认真注意下了。祝你成功。
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7楼2010-04-19 17:09:48
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yuehaihong

银虫 (初入文坛)
我现在也在提酵母细胞中的rna，用的碱抽提法，也提不出来
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挑战每一天
8楼2010-04-20 12:13:03
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我和我自己

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
也有不过柱的试剂盒……比如TAKARA的一些RNA提取试剂盒，原理和Trizol类似的……操作起来还是很方便的……方法应该没有问题……努力提吧……
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9楼2010-04-21 16:41:05
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jingcp200320

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
努力吧，这个可能重复几次，然后细节注意点可能就会功夫不负有心人了
！@
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10楼2010-04-21 17:32:22
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