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铁虫 (小有名气)

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专业: 生物大分子结构与功能

[交流] 【求助/交流】RNA提不出来，万分火急！已有11人参与

大家好，最近一直在用Trizol法提取大肠杆菌总RNA，前几次提取的结果跑电泳只有一条带，应该是5S，特别亮。最近几次在提取过程中将步骤中需要涡旋震荡的均改为轻轻的颠倒混匀，结果有所改善，电泳图上能看到三条带，但23S和16S很弱，5S还是特别亮。如果提的好的话，应该是23S最亮，是16S的2倍亮度，而5S最弱。这应该是降解了吧，可该注意的事项都注意了，还是不行。哎，很着急啊，总RNA提不出来，实验就没法进行。大家多提宝贵意见啊！期待回复。我的操作步骤及电泳图如下：
过夜培养的E.coli O157: H7菌株，1: 100接种于LB培养液，37℃，200rpm振摇培养5h。
取1mL菌液，离心之后，倾出上清，将沉淀的菌体重悬浮于1ml Trizol，混匀，室温孵育5min。
加200μl氯仿，手动振摇15s混匀，室温孵育2~3min后，12000×g，15min，4℃离心。
从上层液中转移出400~600μl无色水相至新离心管中，加异丙醇约500μl，颠倒混匀以沉淀RNA，室温孵育10min后，15000×g，10min，4℃离心。
小心倾去上清，用1ml 75%乙醇重悬浮沉淀，颠倒混匀，7500×g，5min，4℃离心。
倾出上清，风干RNA沉淀，用40μl无RNase水重悬浮RNA沉淀。

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