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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】稳筛C2C12细胞为什么EGFP越来越暗？
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韩丽丽

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】稳筛C2C12细胞为什么EGFP越来越暗？ 已有2人参与

发现筛了一个月的细胞绿色荧光很暗很暗，荧光显微镜下肉眼都看不到，只能靠摄像器材拍到，哪位高手能解释一下？
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1楼 2010-04-07 22:38:03
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韩丽丽

新虫 (小有名气)
我的载体上同时还带的新霉素抗性基因，最后得到的细胞是既有抗药性又有绿色荧光的，刚转染完一个周内细胞都很亮，但越到后来越暗
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3楼2010-04-08 12:27:13
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1): 2010-04-08 19:06
当时我做的时候能看到很亮，尤其是空载GFP。
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智慧活法：不生气，不计较！
2楼2010-04-08 10:48:56
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-08 18:38
引用回帖:
Originally posted by 韩丽丽 at 2010-04-08 12:27:13:
我的载体上同时还带的新霉素抗性基因，最后得到的细胞是既有抗药性又有绿色荧光的，刚转染完一个周内细胞都很亮，但越到后来越暗

质粒上有其他抗药性基因表达很正常，你的目的基因只是GFP融合而已。
一周后越来越暗，意味着瞬时转染的细胞已丢失质粒。
里面也会存在少量的稳定转染细胞，只是其他细胞如没有转染成功的细胞生长过快会将其淹没。

应该加药筛选稳定转染株。
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智慧活法：不生气，不计较！
4楼2010-04-08 16:44:47
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韩丽丽

新虫 (小有名气)
其实我已经得到持续表达GF的细胞克隆，但是扩增后EGFP表达很暗。恩，其实想想，荧光变暗最直接的原因应该是GFP蛋白表达降低，如果我的质粒没有整合到基因组，那应该很好解释，就是说由于细胞不停的分裂，拥有质粒的细胞数相对逐渐减少，相当于是一个稀释效应，再加上不知道大家常说的生长优势（其实我一直不太懂为什么有了外援质粒细胞就会处于生长劣势），表达GFP的细胞会越来越少，这样就会造成GFP越来越暗的效果。可是，我的质粒应当是稳定整合到了基因组中，而且我现在手里的又是稳定表达GFP的细胞克隆扩增得到的大量细胞，镜下看就是满皿都是发暗荧光的细胞，为什么可以随基因组一起复制的GFP会这么暗呢？
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5楼2010-04-08 18:56:50
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