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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】real-time PCR cDNA模板问题已有5人参与

看了不少资料,还是不明白做实时定量PCR时,起始的cDNA模板必须是一致的吗?我目前用的是从1ugRNA中得到的,直接用于实时定量,但用完了。我第一次做反转录时,不知道必须用等量的RNA,所以只是取了1ulRNA 反转录。现在用的cDNA用完了,不知道以前这种方式得到的cDNA是否将浓度调到一致后可以使用?多谢答复。
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匿名

用户注销 (著名写手)

★ ★ ★
1949stone(金币+3):说清楚了 2010-04-07 08:06
本帖仅楼主可见
2楼2010-04-07 04:34:02
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[quote]Originally posted by 彬心玉壶 at 2010-04-07 04:34:02:
1,提RNA
2,测浓度
3,反转成cDNA,这时候要根据你上一步测的浓度,在反转录中加入同样质量的RNA,一般为一个反应反转录250ng,或者500ng的RNA,
4,反转录完成后,稀释5倍或10倍,取2UL做模板做QRT-PCR,最好是 ... [/
我就是不明白加内标不就是为了均一化模板吗?为什么还需要使用等量的RNA 呢?
3楼2010-04-07 04:46:31
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silicare

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优秀版主

gdongli8325(金币+1): 2010-04-07 13:52
不必,有你的内参呢
4楼2010-04-07 08:24:06
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gaozx123

金虫 (小有名气)


scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-07 12:35
gdongli8325(金币+1): 2010-04-07 13:52
将RNA浓度定量到1ug进行反转录,这样得到的cDNA可以认为是均一的,其进行荧光定量PCR时扩增曲线好看,并且较易分析,内参当然是必须的了,所以很能说明问题。
这也只是我所了解到的,希望与大家共同交流。
5楼2010-04-07 08:40:22
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匿名

用户注销 (著名写手)

★ ★ ★ ★
scelab(金币+4):high hand~ :tiger23: 2010-04-08 18:31
本帖仅楼主可见
6楼2010-04-08 15:29:34
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匿名

用户注销 (著名写手)


scelab(金币+1):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-08 18:32
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7楼2010-04-08 15:33:19
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gaozx123

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-09 12:39
同意楼上,用反转录成的cDNA去定量其实是不准确的,可能我们用的是总RNA,所以只能定量RNA浓度之后再反转。
楼主所说的定量cDNA,我想应该是半定量吧,那样调出来的浓度是根据条带的灰度值调的,并不是准确定量。最好还是用RNA定量后反转。
8楼2010-04-09 09:09:24
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刘仕博

金虫 (著名写手)


scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-10 11:47
LZ的问题没太看明白,不过我也一直在做这个。real time-PCR本身就是一个定量的反应,所以在cDNA转录的时候一定要定量,一般都是加1ug的RNA。然后在PCR的时候把模板适当稀释。当然内参也是必须的~
生命在于折腾~
9楼2010-04-09 14:42:48
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