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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】real-time PCR cDNA模板问题
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 gdongli8325 的 3 个金币

gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】real-time PCR cDNA模板问题 已有5人参与

看了不少资料，还是不明白做实时定量PCR时，起始的cDNA模板必须是一致的吗?我目前用的是从1ugRNA中得到的，直接用于实时定量，但用完了。我第一次做反转录时，不知道必须用等量的RNA，所以只是取了1ulRNA 反转录。现在用的cDNA用完了，不知道以前这种方式得到的cDNA是否将浓度调到一致后可以使用？多谢答复。
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1楼 2010-04-07 04:07:19
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匿名

用户注销 (著名写手)
★ ★ ★
1949stone(金币+3):说清楚了 2010-04-07 08:06
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2楼2010-04-07 04:34:02
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)
[quote]Originally posted by 彬心玉壶 at 2010-04-07 04:34:02:
1，提RNA
2，测浓度
3，反转成cDNA，这时候要根据你上一步测的浓度，在反转录中加入同样质量的RNA,一般为一个反应反转录250ng,或者500ng的RNA，
4，反转录完成后，稀释5倍或10倍，取2UL做模板做QRT-PCR，最好是 ... [/
我就是不明白加内标不就是为了均一化模板吗？为什么还需要使用等量的RNA 呢？
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3楼2010-04-07 04:46:31
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
gdongli8325(金币+1): 2010-04-07 13:52
不必，有你的内参呢
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4楼2010-04-07 08:24:06
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-07 12:35
gdongli8325(金币+1): 2010-04-07 13:52
将RNA浓度定量到1ug进行反转录，这样得到的cDNA可以认为是均一的，其进行荧光定量PCR时扩增曲线好看，并且较易分析，内参当然是必须的了，所以很能说明问题。
这也只是我所了解到的，希望与大家共同交流。
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5楼2010-04-07 08:40:22
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匿名

用户注销 (著名写手)
★ ★ ★ ★
scelab(金币+4):high hand~ :tiger23: 2010-04-08 18:31
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6楼2010-04-08 15:29:34
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-08 18:32
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7楼2010-04-08 15:33:19
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-09 12:39
同意楼上，用反转录成的cDNA去定量其实是不准确的，可能我们用的是总RNA，所以只能定量RNA浓度之后再反转。
楼主所说的定量cDNA，我想应该是半定量吧，那样调出来的浓度是根据条带的灰度值调的，并不是准确定量。最好还是用RNA定量后反转。
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8楼2010-04-09 09:09:24
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刘仕博

金虫 (著名写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-10 11:47
LZ的问题没太看明白，不过我也一直在做这个。real time-PCR本身就是一个定量的反应，所以在cDNA转录的时候一定要定量，一般都是加1ug的RNA。然后在PCR的时候把模板适当稀释。当然内参也是必须的~
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生命在于折腾~
9楼2010-04-09 14:42:48
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