24小时热门版块排行榜    

查看: 1475  |  回复: 8
当前主题已经存档。
【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 gdongli8325 的 3 个金币

gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】real-time PCR cDNA模板问题 已有5人参与

看了不少资料,还是不明白做实时定量PCR时,起始的cDNA模板必须是一致的吗?我目前用的是从1ugRNA中得到的,直接用于实时定量,但用完了。我第一次做反转录时,不知道必须用等量的RNA,所以只是取了1ulRNA 反转录。现在用的cDNA用完了,不知道以前这种方式得到的cDNA是否将浓度调到一致后可以使用?多谢答复。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)

★ ★ ★
1949stone(金币+3):说清楚了 2010-04-07 08:06
本帖仅楼主可见
2楼2010-04-07 04:34:02
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[quote]Originally posted by 彬心玉壶 at 2010-04-07 04:34:02:
1,提RNA
2,测浓度
3,反转成cDNA,这时候要根据你上一步测的浓度,在反转录中加入同样质量的RNA,一般为一个反应反转录250ng,或者500ng的RNA,
4,反转录完成后,稀释5倍或10倍,取2UL做模板做QRT-PCR,最好是 ... [/
我就是不明白加内标不就是为了均一化模板吗?为什么还需要使用等量的RNA 呢?
3楼2010-04-07 04:46:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主

gdongli8325(金币+1): 2010-04-07 13:52
不必,有你的内参呢
4楼2010-04-07 08:24:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaozx123

金虫 (小有名气)

★
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-07 12:35
gdongli8325(金币+1): 2010-04-07 13:52
将RNA浓度定量到1ug进行反转录,这样得到的cDNA可以认为是均一的,其进行荧光定量PCR时扩增曲线好看,并且较易分析,内参当然是必须的了,所以很能说明问题。
这也只是我所了解到的,希望与大家共同交流。
5楼2010-04-07 08:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)

★ ★ ★ ★
scelab(金币+4):high hand~ :tiger23: 2010-04-08 18:31
本帖仅楼主可见
6楼2010-04-08 15:29:34
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

匿名

用户注销 (著名写手)

★
scelab(金币+1):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-08 18:32
本帖仅楼主可见
7楼2010-04-08 15:33:19
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

gaozx123

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-09 12:39
同意楼上,用反转录成的cDNA去定量其实是不准确的,可能我们用的是总RNA,所以只能定量RNA浓度之后再反转。
楼主所说的定量cDNA,我想应该是半定量吧,那样调出来的浓度是根据条带的灰度值调的,并不是准确定量。最好还是用RNA定量后反转。
8楼2010-04-09 09:09:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘仕博

金虫 (著名写手)

★
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-10 11:47
LZ的问题没太看明白,不过我也一直在做这个。real time-PCR本身就是一个定量的反应,所以在cDNA转录的时候一定要定量,一般都是加1ug的RNA。然后在PCR的时候把模板适当稀释。当然内参也是必须的~
生命在于折腾~
9楼2010-04-09 14:42:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 gdongli8325 的主题更新
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 6/300 2026-11-11 04:12 by Z7qfCsdIiD1T
[公派出国] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 5/250 2026-11-11 04:01 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 5/250 2026-11-11 00:59 by Z7qfCsdIiD1T
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 22:47 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 22:39 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 21:02 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 20:51 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-10 20:45 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-10 20:12 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 20:07 by Z7qfCsdIiD1T
[考博] 申请环境,微生物方向博士 +3 浅笑09 2026-11-08 3/150 2026-11-10 12:44 by 可淡不可忘
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”:确已离世,正核实举报内容 +4 yexuqing 2026-11-04 6/300 2026-11-10 11:13 by susizheng
[考博] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 01:29 by FChKX8meu1ds
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考研] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 15/750 2026-11-09 13:19 by Equinoxhua
[硕博家园] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 10/500 2026-11-09 08:00 by IhnEQauGmT3K
[硕博家园] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
信息提示
请填处理意见