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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么跑出的RNA电泳图只有一条带，而且很亮？
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

我也请教老先生一下

★
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Originally posted by DNAhelix at 2010-04-07 10:24:46:


真的不明白。
提取RNA时，因为rRNA表达量大，而rRNA又分为28S， 18S， 5.8S及5S，跑胶时一般看到三条带。
如果单纯提取mRNA,那么应该是smear带才对吧！
请赐教！

[ Last edited by DNAhelix on 2010-4 ...

请问细胞里表达量最大的是哪个RNA？很明显被降解最快的表达量最大，无疑---mRNA。而最稳定的表达量最少哦，谁啊——r,tRNA啊。我第一次回复时说过，你要是为了单独检测一种RNA那你要的条带肯定是你预设的，说rRNA。你说有三条带，对，我没说错。但是但如直接提取rRNA的方法我还么见过，就见过mRNA的方法，此外就是提取总的RNA的方法了，你在你第一次发帖的稍稍下方有个“编辑”链接，你点击，把图片传上来。把你要做的实验的目的说清楚点，我现在都让你搞蒙了。把图片的链接粘贴到文章里就OK了。试试看吧！
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11楼2010-04-07 10:31:50
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

请教一下

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Originally posted by 谁知道 at 2010-04-06 22:09:25:
我用trizo法提取的细菌RNA，分光光度计检测其浓度为100ng/微升，260/280为1.9 ， 260/230为2.25l ，可为什么跑出的RNA电泳图只有一条带，而且很亮呢？

“260/230为2.25l ”是什么意思，我就知道260和280真没见过230.还有 RNA 纯品的 OD 260 /OD 280 的比值为 2.0 ，故根据 OD 260 /OD 280 的比值可以估计 RNA 的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示 RNA 有降解。 望能回复一下。谢谢！
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12楼2010-04-07 10:46:58
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
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scelab(金币+5):high hand~ :tiger23: 2010-04-07 12:41
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Originally posted by wangqk198738 at 2010-04-07 10:31:50:

请问细胞里表达量最大的是哪个RNA？很明显被降解最快的表达量最大，无疑---mRNA。而最稳定的表达量最少哦，谁啊——r,tRNA啊。我第一次回复时说过，你要是为了单独检测一种RNA那你要的条带肯定是你预设的，说rR ...

楼主你弄混了吧，不是指总的mRNA,意思是总mRNA跑胶，你说会有一条带出现，既然出现某条带，一般是针对某个基因而已，顶多掺杂难以分辨的核苷酸数接近的基因，所以我前面问是什么基因的条带？！如果总mRNA有条带出现，那么在总RNA检测中就不会只看到rRNA的三条带了。

这里的表达量大不是指总mRNA,总rRNA、总tRNA.
不大赞同这一说法：很明显被降解最快的表达量最大，无疑---mRNA。而最稳定的表达量最少哦。
个人认为降解速率与表达量之间不是正比关系，比如检测到某基因的量大，那么有可能是表达量大及降解速度小的结果。

另外一般而言，RNA电泳图，要么是总RNA电泳图，要么是总mRNA电泳图，如果楼主真的是具体到目的mRNA,他也不会为是一条带而发愁，另外mRNA检测即使具体到特定的mRNA,估计不会看到条带，一条很亮的条带。

讨教了！
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13楼2010-04-07 10:57:33
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wangqk198738

金虫 (正式写手)
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scelab(金币+5):high hand~ :tiger23: 2010-04-07 12:40
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Originally posted by DNAhelix at 2010-04-07 10:57:33:


楼主你弄混了吧，不是指总的mRNA,意思是总mRNA跑胶，你说会有一条带出现，既然出现某条带，一般是针对某个基因而已，顶多掺杂难以分辨的核苷酸数接近的基因，所以我前面问是什么基因的条带？！如果总mRNA有条 ...

我真是让你的问题搞得一头雾水。你是说一种mRNA的总量。还是说一个细胞里的总mRNA量（不一定是一种而是多种）那要找你的意思说就得赖你了，你要是连自己想克隆什么片段都不知道，怎么设计的引物啊？要是说提取总RNA我们检测就看它有没有RNA即可。我说的两条带是检测的结果，mRNA和t,rRNA分成两队。这回明白了吧！这种情况出现一条带说明你跑的不好。要是单纯的mRNA那肯定是一条带了。这回明白了吧！祝好——共勉。
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14楼2010-04-07 12:05:57
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wangqk198738

金虫 (正式写手)
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Originally posted by DNAhelix at 2010-04-07 10:57:33:


楼主你弄混了吧，不是指总的mRNA,意思是总mRNA跑胶，你说会有一条带出现，既然出现某条带，一般是针对某个基因而已，顶多掺杂难以分辨的核苷酸数接近的基因，所以我前面问是什么基因的条带？！如果总mRNA有条 ...

我真是让你的问题搞得一头雾水。你是说一种mRNA的总量。还是说一个细胞里的总mRNA量（不一定是一种而是多种）那要找你的意思说就得赖你了，你要是连自己想克隆什么片段都不知道，怎么设计的引物啊？要是说提取总RNA我们检测就看它有没有RNA即可。我说的两条带是检测的结果，mRNA和t,rRNA分成两队。这回明白了吧！这种情况出现一条带说明你跑的不好。要是单纯的mRNA那肯定是一条带了。这回明白了吧！祝好——共勉。
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15楼2010-04-07 12:11:38
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
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Originally posted by wangqk198738 at 2010-04-07 12:11:38:

我真是让你的问题搞得一头雾水。你是说一种mRNA的总量。还是说一个细胞里的总mRNA量（不一定是一种而是多种）那要找你的意思说就得赖你了，你要是连自己想克隆什么片段都不知道，怎么设计的引物啊？要是说提取总 ...

一般到逆转才用到引物，那么它的产物是cDNA.
并非在RNA阶段！
退一步来说，即使他提取的是单一的mRNA,也不可能跑出一条亮带！
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16楼2010-04-07 12:19:22
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

对，但是也错

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Originally posted by DNAhelix at 2010-04-07 12:19:22:


一般到逆转才用到引物，那么它的产物是cDNA.
并非在RNA阶段！
退一步来说，即使他提取的是单一的mRNA,也不可能跑出一条亮带！

对于cDNA克隆来讲：要是很纯的模板，条带是单一的，要是有两条带就只能说明有较多的杂质。不信你下次做实验掺杂一点试试看。
要是一种细胞或组织的总mRNA，你用来检测目的就是想知道有没有，条带也是单一的，这跟你 制胶有关。你用大孔的，自然跑的时候速率差不多一样快，怎么区分，所以说我们不用来区分它们，我们只要知道有没有就行了。要是还有一条微微的带，那不要紧，肯定有小分子的RNA了，你分析的时候说明就是了。整个楼层就是我跟楼主讨论了。不过楼主打破沙锅问到底的精神很好啊。我还是那句话，拿到以前的老文章，肯定会有相关知识，现在的文章都不提了，因为这是很间的事情大家都不在乎。但也要有证据证明你的RNA存在。
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17楼2010-04-07 12:30:20
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DNAhelix

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Originally posted by wangqk198738 at 2010-04-07 12:30:20:


对于cDNA克隆来讲：要是很纯的模板，条带是单一的，要是有两条带就只能说明有较多的杂质。不信你下次做实验掺杂一点试试看。
要是一种细胞或组织的总mRNA，你用来检测目的就是想知道有没有，条带也是单一的， ...

偶们没说到一块去！
我的意思是：即使你提取到的是单一mRNA,一般情况而言，电泳后极可能看不到条带（一般量不足）。何况目前为止，我没看到相关文献有纯化到单一的mRNA，也许是我孤陋寡闻了。
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18楼2010-04-07 12:37:44
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

对了

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Originally posted by DNAhelix at 2010-04-07 12:37:44:


偶们没说到一块去！
我的意思是：即使你提取到的是单一mRNA,一般情况而言，电泳后极可能看不到条带（一般量不足）。何况目前为止，我没看到相关文献有纯化到单一的mRNA，也许是我孤陋寡闻了。

目前是没有提取单一mRNA的方法，一般是总的，我说的是这个。你说提取的mRNA还跑出两条带了，大概有这种可能吧，我还真没见过。不过你不用担心，你不是说了吗，下面就是克隆了，有么有还得下面说了算的。能P出来就有，去NCBI上对比一下。有就成功了，保存好菌种害怕吗？对伐？要是说能跑出多条带，除非你是想直接在RNA层面检测，但是一般不可取。那样既浪费又麻烦。文章你可别说没有，肯定有的，九几年的。试试看！
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19楼2010-04-07 12:49:53
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DNAhelix

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Originally posted by wangqk198738 at 2010-04-07 12:49:53:


目前是没有提取单一mRNA的方法，一般是总的，我说的是这个。你说提取的mRNA还跑出两条带了，大概有这种可能吧，我还真没见过。不过你不用担心，你不是说了吗，下面就是克隆了，有么有还得下面说了算的。能P出 ...

我的意思是：总mRNA跑电泳没条带，总RNA电泳有三条带（前提是质量好）。
你说跑mRNA有条带，我问是什么条带。

本人认为是总mRNA电泳是smear带，就像楼上有人说的，是竖的吧，意思是smear条带。

PS：stop,谢谢这位虫友说了这么多。
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20楼2010-04-07 13:00:12
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