24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 918  |  回复: 15
当前主题已经存档。
【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 pidou 的 1 个金币

pidou

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR结果分析 已有8人参与

今天刚刚做的RT-PCR,结果很伤心。下面的两张图片是同一张,只不过是有一张做了强光处理。
1、我要的片段在700bp左右,在700bp左右有一条带,但是很模糊!!这算是P出来了吗???
请大家帮助分析一下模糊的原因?如何改善?






2、如何确定第一链cDNA的生成情况?
3、最下面的模糊条带应该算是引物了吧?

[ Last edited by pidou on 2010-4-3 at 22:13 ]
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pidou

木虫 (正式写手)

真的那么难分析吗??为什么没有人帮忙呢??
2楼2010-04-04 09:21:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流!:tiger06: 2010-04-04 12:19
pidou(金币+1):谢谢你啊 2010-04-05 00:40
不好说,也可能是你的mRNA丰度太低,你可以有带的地方(700bp左右的胶)切下来,冷冻后离心,拿离下来的液体做模板做一次pcr,看看有没有效果;
另外会不会是你的rt-pcr条件不合适;
在可能就是你的RNA提的不好

[ Last edited by fungixx on 2010-4-4 at 11:21 ]
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-04-04 11:19:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)

我觉得PCR条件再优化一下看看,结果不是很好,也许是引物的问题
4楼2010-04-04 16:55:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1514132

至尊木虫 (著名写手)

降低退火温度,试一下。
5楼2010-04-04 18:42:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pidou

木虫 (正式写手)

那条带是不是太浅了点啊???应该达到多少才适合回收啊?
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-04-04 11:19:50:
不好说,也可能是你的mRNA丰度太低,你可以有带的地方(700bp左右的胶)切下来,冷冻后离心,拿离下来的液体做模板做一次pcr,看看有没有效果;
另外会不会是你的rt-pcr条件不合适;
在可能就是你的RNA提的不好 ...

6楼2010-04-05 00:39:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pidou

木虫 (正式写手)

我的引物是别人用过的了,是简并行引物,这个我觉得应该不会有什么影响吧??
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-04 16:55:32:
我觉得PCR条件再优化一下看看,结果不是很好,也许是引物的问题

7楼2010-04-05 00:41:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

angel2536

金虫 (著名写手)

★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流!:tiger06: 2010-04-05 11:45
pidou(金币+1):好的,谢谢哦 2010-04-06 17:12
从强光那张看,算是P出来了,不过相当弱啊,好像还有非特异性扩增,不知道是多少个循环扩出的带!
可以试下提高模板浓度,另外可以做下温度梯度PCR,优化下退火温度,选个最佳的温度进行扩增。
8楼2010-04-05 10:53:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

DNAhelix

银虫 (著名写手)

pidou(金币+1):谢谢你的回复,但是假如我的cDNA质量是不变的,请问如何才能增加PCR的产量?或者说cDNA的质量影响有多大? 2010-04-06 17:12
1、提高RNA浓度,可以试试降落PCR。
2、要判断你的目的cDNA有难度,通常浓度低,跑胶看不出来。如果你用的通用引物逆转,应该看到smear现象。在逆转前可以快速跑个胶看看提取的RNA质量如何?
3、最前面的应该是引物二聚体。
智慧活法:不生气,不计较!
9楼2010-04-05 13:50:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pidou

木虫 (正式写手)

优化温度的话一般温度差多少为好?
引用回帖:
Originally posted by angel2536 at 2010-04-05 10:53:37:
从强光那张看,算是P出来了,不过相当弱啊,好像还有非特异性扩增,不知道是多少个循环扩出的带!
可以试下提高模板浓度,另外可以做下温度梯度PCR,优化下退火温度,选个最佳的温度进行扩增。

10楼2010-04-06 17:13:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 pidou 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 286求调剂 +25 Faune 2026-04-06 25/1250 2026-04-11 23:23 by labixiaoqiao
[考研] 293求调剂 +8 勇远库爱314 2026-04-06 8/400 2026-04-11 20:25 by 蓝云思雨
[考研] 085404 293求调剂 +9 勇远库爱314 2026-04-06 10/500 2026-04-11 10:36 by 紫曦紫棋
[考研] 中药学调剂 初试324 +4 洋甘菊、 2026-04-10 6/300 2026-04-11 09:41 by gong120082
[考研] 一志愿东北大学控制工程085406数二英二385,求调剂 +8 Ezra_Zhang 2026-04-09 8/400 2026-04-11 09:15 by 猪会飞
[考研] 考研调剂 +26 硕星赴 2026-04-09 27/1350 2026-04-10 22:24 by 猪会飞
[考研] 263能源动力专硕求调剂 +4 加大号饭盒袋 2026-04-10 4/200 2026-04-10 20:52 by gong120082
[考研] 284求调剂 +9 让我上岸吧阿西 2026-04-09 11/550 2026-04-10 19:18 by 靖jing
[考研] 一志愿沪9,326生物学求相关专业调剂 +4 刘墨墨 2026-04-09 4/200 2026-04-10 12:07 by pengliang8036
[考研] 一志愿鲁东大学071000生物学学硕初试分数276求调剂 +20 慕绝cc 2026-04-09 24/1200 2026-04-10 10:22 by xujun0624
[考研] 277求调剂 +19 倪建设 2026-04-06 19/950 2026-04-10 09:24 by guosr9609
[考研] 301求调剂 +6 静静想想 2026-04-05 6/300 2026-04-10 09:15 by Delta2012
[考研] 一志愿2110,化学学硕310分,本科重点双非求调剂 +18 努力奋斗112 2026-04-08 18/900 2026-04-09 23:28 by wolf97
[考研] 材料与化工专硕306分找合适调剂 +27 沧海轻舟e 2026-04-06 28/1400 2026-04-08 22:06 by wdyheheeh
[考研] 277求调剂 +4 考研调剂lxh 2026-04-06 6/300 2026-04-08 10:40 by 逆水乘风
[考研] 11408 325分 +3 jgtxuxgkx 2026-04-07 3/150 2026-04-07 23:10 by lbsjt
[考研] 一志愿西电085401求调剂 +4 sunw1306 2026-04-07 4/200 2026-04-07 16:40 by 啵啵啵0119
[考研] 软工学硕299求调剂 +6 useryy 2026-04-07 6/300 2026-04-07 09:50 by vgtyfty
[考研] 287分求调剂 有专利国奖一志愿哈工大085406 +6 白易辰 2026-04-06 7/350 2026-04-06 22:46 by 875465
[考研] 求调剂到0856材料工程 +3 程9915 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:15 by 蓝云思雨
信息提示
请填处理意见