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pidou

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR结果分析 已有8人参与

今天刚刚做的RT-PCR,结果很伤心。下面的两张图片是同一张,只不过是有一张做了强光处理。
1、我要的片段在700bp左右,在700bp左右有一条带,但是很模糊!!这算是P出来了吗???
请大家帮助分析一下模糊的原因?如何改善?






2、如何确定第一链cDNA的生成情况?
3、最下面的模糊条带应该算是引物了吧?

[ Last edited by pidou on 2010-4-3 at 22:13 ]
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pidou

木虫 (正式写手)

真的那么难分析吗??为什么没有人帮忙呢??
2楼2010-04-04 09:21:09
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流!:tiger06: 2010-04-04 12:19
pidou(金币+1):谢谢你啊 2010-04-05 00:40
不好说,也可能是你的mRNA丰度太低,你可以有带的地方(700bp左右的胶)切下来,冷冻后离心,拿离下来的液体做模板做一次pcr,看看有没有效果;
另外会不会是你的rt-pcr条件不合适;
在可能就是你的RNA提的不好

[ Last edited by fungixx on 2010-4-4 at 11:21 ]
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-04-04 11:19:50
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

我觉得PCR条件再优化一下看看,结果不是很好,也许是引物的问题
4楼2010-04-04 16:55:32
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1514132

至尊木虫 (著名写手)

降低退火温度,试一下。
5楼2010-04-04 18:42:05
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pidou

木虫 (正式写手)

那条带是不是太浅了点啊???应该达到多少才适合回收啊?
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-04-04 11:19:50:
不好说,也可能是你的mRNA丰度太低,你可以有带的地方(700bp左右的胶)切下来,冷冻后离心,拿离下来的液体做模板做一次pcr,看看有没有效果;
另外会不会是你的rt-pcr条件不合适;
在可能就是你的RNA提的不好 ...

6楼2010-04-05 00:39:42
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pidou

木虫 (正式写手)

我的引物是别人用过的了,是简并行引物,这个我觉得应该不会有什么影响吧??
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-04 16:55:32:
我觉得PCR条件再优化一下看看,结果不是很好,也许是引物的问题

7楼2010-04-05 00:41:20
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angel2536

金虫 (著名写手)

★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流!:tiger06: 2010-04-05 11:45
pidou(金币+1):好的,谢谢哦 2010-04-06 17:12
从强光那张看,算是P出来了,不过相当弱啊,好像还有非特异性扩增,不知道是多少个循环扩出的带!
可以试下提高模板浓度,另外可以做下温度梯度PCR,优化下退火温度,选个最佳的温度进行扩增。
8楼2010-04-05 10:53:37
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DNAhelix

银虫 (著名写手)

pidou(金币+1):谢谢你的回复,但是假如我的cDNA质量是不变的,请问如何才能增加PCR的产量?或者说cDNA的质量影响有多大? 2010-04-06 17:12
1、提高RNA浓度,可以试试降落PCR。
2、要判断你的目的cDNA有难度,通常浓度低,跑胶看不出来。如果你用的通用引物逆转,应该看到smear现象。在逆转前可以快速跑个胶看看提取的RNA质量如何?
3、最前面的应该是引物二聚体。
智慧活法:不生气,不计较!
9楼2010-04-05 13:50:27
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pidou

木虫 (正式写手)

优化温度的话一般温度差多少为好?
引用回帖:
Originally posted by angel2536 at 2010-04-05 10:53:37:
从强光那张看,算是P出来了,不过相当弱啊,好像还有非特异性扩增,不知道是多少个循环扩出的带!
可以试下提高模板浓度,另外可以做下温度梯度PCR,优化下退火温度,选个最佳的温度进行扩增。

10楼2010-04-06 17:13:10
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