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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RT-PCR结果分析
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pidou

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR结果分析已有8人参与

今天刚刚做的RT-PCR，结果很伤心。下面的两张图片是同一张，只不过是有一张做了强光处理。
1、我要的片段在700bp左右，在700bp左右有一条带，但是很模糊！！这算是P出来了吗？？？
请大家帮助分析一下模糊的原因？如何改善？






2、如何确定第一链cDNA的生成情况？
3、最下面的模糊条带应该算是引物了吧？

[ Last edited by pidou on 2010-4-3 at 22:13 ]
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1楼2010-04-03 22:10:26
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pidou

木虫 (正式写手)
真的那么难分析吗？？为什么没有人帮忙呢？？
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2楼2010-04-04 09:21:09
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流！:tiger06: 2010-04-04 12:19
pidou(金币+1):谢谢你啊 2010-04-05 00:40
不好说，也可能是你的mRNA丰度太低，你可以有带的地方（700bp左右的胶）切下来，冷冻后离心，拿离下来的液体做模板做一次pcr，看看有没有效果；
另外会不会是你的rt-pcr条件不合适；
在可能就是你的RNA提的不好

[ Last edited by fungixx on 2010-4-4 at 11:21 ]
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-04-04 11:19:50
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
我觉得PCR条件再优化一下看看，结果不是很好，也许是引物的问题
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4楼2010-04-04 16:55:32
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1514132

至尊木虫 (著名写手)
降低退火温度，试一下。
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5楼2010-04-04 18:42:05
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pidou

木虫 (正式写手)
那条带是不是太浅了点啊？？？应该达到多少才适合回收啊？
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-04-04 11:19:50:
不好说，也可能是你的mRNA丰度太低，你可以有带的地方（700bp左右的胶）切下来，冷冻后离心，拿离下来的液体做模板做一次pcr，看看有没有效果；
另外会不会是你的rt-pcr条件不合适；
在可能就是你的RNA提的不好 ...

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6楼2010-04-05 00:39:42
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pidou

木虫 (正式写手)
我的引物是别人用过的了，是简并行引物，这个我觉得应该不会有什么影响吧？？
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-04 16:55:32:
我觉得PCR条件再优化一下看看，结果不是很好，也许是引物的问题

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7楼2010-04-05 00:41:20
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angel2536

金虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流！:tiger06: 2010-04-05 11:45
pidou(金币+1):好的，谢谢哦 2010-04-06 17:12
从强光那张看，算是P出来了，不过相当弱啊，好像还有非特异性扩增，不知道是多少个循环扩出的带！
可以试下提高模板浓度，另外可以做下温度梯度PCR，优化下退火温度，选个最佳的温度进行扩增。
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8楼2010-04-05 10:53:37
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DNAhelix

银虫 (著名写手)
pidou(金币+1):谢谢你的回复，但是假如我的cDNA质量是不变的，请问如何才能增加PCR的产量？或者说cDNA的质量影响有多大？ 2010-04-06 17:12
1、提高RNA浓度，可以试试降落PCR。
2、要判断你的目的cDNA有难度，通常浓度低，跑胶看不出来。如果你用的通用引物逆转，应该看到smear现象。在逆转前可以快速跑个胶看看提取的RNA质量如何？
3、最前面的应该是引物二聚体。
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智慧活法：不生气，不计较！
9楼2010-04-05 13:50:27
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pidou

木虫 (正式写手)
优化温度的话一般温度差多少为好？
引用回帖:
Originally posted by angel2536 at 2010-04-05 10:53:37:
从强光那张看，算是P出来了，不过相当弱啊，好像还有非特异性扩增，不知道是多少个循环扩出的带！
可以试下提高模板浓度，另外可以做下温度梯度PCR，优化下退火温度，选个最佳的温度进行扩增。

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10楼2010-04-06 17:13:10
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