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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于质粒提取和后续双酶切实验
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bayleaf1987

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】关于质粒提取和后续双酶切实验

最近做载体构建，有几个遇到的问题想和大家探讨一下~
1.看了相关资料，了解到一般抽提质粒跑胶验证应该有三条带，如果我直接用这个质粒做后续的酶切，双酶切之后得到目的片段（小，约1000bp）和剩余片段（大），我想问的是剩余片段与对照质粒的三条带相比大致是怎样一个位置状况？（构建的载体是pBI121）
2.双酶切的体系问题~我是新手，查了文献，说体系一般有20，50，100ul，实际操作中这三种体系效果差别大吗？如果我想做大体系，体系中质粒，buffer，和酶的比例有没有特定要求？还有，如何确定体系中到底要不要加BSA？
敬请高手指导~~~~~~~
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1楼 2010-03-31 10:46:24
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chjvke

铜虫 (初入文坛)
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amisking(金币+2): 2010-03-31 13:40
第一：个人觉得酶切之后不用点质粒作对照，如果出现剩余的大片段，我指的是比载体还大的，那可能是加的质粒太多，没有切完全的。
第二：一般酶切时，buffer是体系的十分之一。我们一般只做10ul，20ul体系，因为体系太大的话，可能酶切效果不是很好。
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2楼2010-03-31 11:55:37
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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amisking(金币+3): 2010-03-31 13:40
1，如果要拿对照质粒做对照的话，最好是把对照质粒单酶切，这样跑出来就会是一条带，效果显而易见；
2，体系我一般一般做20，50ul，要是多的话多做几管即可。一般质粒酶切1ul，另外宁少勿多，保证充分切割，这对后续筛选十分有利；注意连接是至少保证片段：质粒>3
3，至于要不要加BSA你要看公司双酶切表，一般都会有的
赞一下(3人) 回复此楼
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
3楼2010-03-31 13:20:57
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