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gydgs033

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】引物测序结果疑问??

我的PCR目的产物131bp,在英俊测序(使用上下游引物同时测序),但是经常出英俊公司回复测序结果是双峰或前双峰,请问双峰和前双峰所代表的意义及产生的原因?由于我测序的目的是看是否有点突变,使用测序结果与目的产物序列比对发现,使用上游引物测序结果与目的产物序列在47bp处出现突变,目的产物为A,测序为T,但用下游引物测序在该位置无突变,请问原因?另问基因点突变是指正义链某碱基突变,而反义链也伴随其突变,还是只有正译链突变,反义链不变???请教高手???
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段家一凡

木虫 (正式写手)

gydgs033(金币+2): 2010-03-29 13:43
双峰说明PCR产物中有两个不同的片段,前双峰可能是两种不同的PCR产物,前段不一样,后面一样。基因点突变是两条链都突变了。你可以把你的PCR产物连入载体,再测序,可能会清楚一点。
2楼2010-03-28 16:24:57
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主

gydgs033(金币+1): 2010-03-29 13:43
克隆后再测测试试
3楼2010-03-28 16:56:25
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gydgs033

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 段家一凡 at 2010-03-28 16:24:57:
双峰说明PCR产物中有两个不同的片段,前双峰可能是两种不同的PCR产物,前段不一样,后面一样。基因点突变是两条链都突变了。你可以把你的PCR产物连入载体,再测序,可能会清楚一点。

再请教一下:我的测序结果虽然说是双峰,但是他们只给出一个序列,并且我和目的序列比对之后却是100%一样,这可以说我P成功了么,还是一定要以单双峰为准啊?
另外,我提供的虽是PCR产物,但是公司是负责给纯化的,引物也都是PAGE纯化的,这种情况还需要克隆之后再测序么?
4楼2010-03-29 13:48:00
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by gydgs033 at 2010-03-29 13:48:00:

再请教一下:我的测序结果虽然说是双峰,但是他们只给出一个序列,并且我和目的序列比对之后却是100%一样,这可以说我P成功了么,还是一定要以单双峰为准啊?
另外,我提供的虽是PCR产物,但是公司是负责给纯化 ...

我觉得你的结果可信了,不用克隆了,不过你那一个突变不知道是否是真的突变,再测一个样吧
5楼2010-03-29 14:17:37
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6楼2010-03-29 16:29:48
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虫虫博士

新虫 (小有名气)

既然反向引物测的是不突变的,说明就是没有突变,死心吧,此位置没有突变。
7楼2010-03-29 17:36:31
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