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chengkun

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】高通量筛选

各位高手,最近我要用96孔板作高通量筛选。具体的情况是:我用枯草芽孢杆菌构建蛋白酶的突变文库,筛选时用96孔板,底物选一种合成的复合底物AAPF。具体做时,遇到了一些问题,如底物的使用浓度,反应时间等。其中我最迷惑不解的是如何确定底物AAPF的使用浓度,那位高手能够指点一下,谢谢了。急!
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delia1013

木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1): 2010-03-24 18:15
底物选择在0.2--5Km 即可
2楼2010-03-24 17:21:39
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chengkun

金虫 (正式写手)

那再请教个问题,是否需要做一个预备试验,检测一下不同底物浓度下的酶反应速度与时间的关系曲线?每个浓度会各有一条曲线,那究竟该选哪个浓度呢?
3楼2010-03-24 17:34:21
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delia1013

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-03-24 18:16
底物浓度选择在上述范围内,当底物浓度饱和时即可达到最大反应速率,拉底物梯度,可拟合得到Km和V
如果仅为了进行高通量筛选,可选择10倍Km作为底物浓度。
4楼2010-03-24 18:11:14
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chengkun

金虫 (正式写手)

谢谢您了
5楼2010-03-24 20:29:42
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DZY20060901

铜虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我现做HTS, Kd值如何求?请楼上解答。谢谢!
DZY
6楼2010-03-24 21:11:10
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delia1013

木虫 (著名写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
Kd是解离常数,数值上等于平衡常数的倒数
对于最简单的单位点结合,P+L-----PL
Kd=[P]*[L]/[PL],运用质量守恒可得θ=[L]/(Kd+[L]),L是配体浓度,θ是饱和分数。如果有n个结合位点,就要拟合两个参数n 和Kd。具体看看书吧,公式自己推一下。得到的实验数据可用oringe or  sigmaplot拟合
还有可以考虑做ITC,可以单次实验得到n和Kd
7楼2010-03-25 09:32:12
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DZY20060901

铜虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
谢谢!我先算算。我的应该是n=1, 有推算说Kd可取50%的位置对应的浓度,是否准确?有没荧光方面的参考书推荐一下。
DZY
8楼2010-03-27 14:54:32
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