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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】高通量筛选
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chengkun

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】高通量筛选

各位高手，最近我要用96孔板作高通量筛选。具体的情况是：我用枯草芽孢杆菌构建蛋白酶的突变文库，筛选时用96孔板，底物选一种合成的复合底物AAPF。具体做时，遇到了一些问题，如底物的使用浓度，反应时间等。其中我最迷惑不解的是如何确定底物AAPF的使用浓度，那位高手能够指点一下，谢谢了。急！
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1楼 2010-03-24 14:25:36
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delia1013

木虫 (著名写手)
★ ★
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amisking(金币+1): 2010-03-24 18:15
底物选择在0.2--5Km 即可
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2楼2010-03-24 17:21:39
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chengkun

金虫 (正式写手)
那再请教个问题，是否需要做一个预备试验，检测一下不同底物浓度下的酶反应速度与时间的关系曲线？每个浓度会各有一条曲线，那究竟该选哪个浓度呢？
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3楼2010-03-24 17:34:21
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delia1013

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 2010-03-24 18:16
底物浓度选择在上述范围内，当底物浓度饱和时即可达到最大反应速率，拉底物梯度，可拟合得到Km和V
如果仅为了进行高通量筛选，可选择10倍Km作为底物浓度。
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4楼2010-03-24 18:11:14
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chengkun

金虫 (正式写手)
谢谢您了
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5楼2010-03-24 20:29:42
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DZY20060901

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我现做HTS, Kd值如何求？请楼上解答。谢谢！
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DZY
6楼2010-03-24 21:11:10
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delia1013

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
Kd是解离常数，数值上等于平衡常数的倒数
对于最简单的单位点结合，P+L-----PL
Kd=[P]*[L]/[PL],运用质量守恒可得θ=[L]/(Kd+[L]),L是配体浓度，θ是饱和分数。如果有n个结合位点，就要拟合两个参数n 和Kd。具体看看书吧，公式自己推一下。得到的实验数据可用oringe or  sigmaplot拟合
还有可以考虑做ITC，可以单次实验得到n和Kd
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7楼2010-03-25 09:32:12
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DZY20060901

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
谢谢！我先算算。我的应该是n=1, 有推算说Kd可取50%的位置对应的浓度，是否准确？有没荧光方面的参考书推荐一下。
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DZY
8楼2010-03-27 14:54:32
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