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[交流]
【求助/交流】测定萜类合酶TPS的一种生化实验方法，大家看看是否可行？
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萜类合成酶是萜类化合物生物合成过程中的关键酶之一。分别催化前体底物GPP、FPP、和GGPP，形成单萜、倍半萜和二萜。大多数萜类合成酶都是可溶性的酸性蛋白，天然分子质量在35~80 ku之间，其催化反应依赖2价金属阳离子（如Mg2+，Mn2+，Fe2+等），萜烯合成酶根据其功能可以分为3大类，分别是单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶。其中单萜合成酶的等电点值大约在pH 6左右，其最佳pH范围在6.8~7.8之间。通常裸子植物的萜烯合成酶要比被子植物的萜烯合成酶偏高些，最适pH值偏碱性。裸子植物单萜合成酶的催化作用不仅依赖2价金属离子（但更偏好Mn2+），而且还需要单价阳离子（如K+）来激活，该特性是被子植物单萜合成酶所不具有的。 1 蛋白质的提取 每次从4棵油松树苗取相似部位的木质部组织样本（材料组织共10g）作为一个蛋白提取点，使用液氮分析磨研磨。研磨后加入缓冲液。 缓冲液配方： 50 mM MOPSO，pH 6.8； 5 mM 抗坏血酸； 5 mM NaHSO3； 5 mM 二硫苏糖醇(DTT)； 10 mM MgCl2； 1 mM EDTA； 10% [v/v] 甘油； 1% [w/v] (PVP)聚乙烯吡咯烷酮 [Mr 10,000]； 4% [w/v] (PVPP) 聚乙烯聚吡咯烷酮； 4% [w/v] amberlite XAD-4；苯酚甲醛离子交换树脂 0.1% [v/v] Tween 20 比率1:10 (g tissue : mL buffer). 缓冲液的温度保持4°C，震荡30 min，然后低温离心10,000 g, 30 min。取上层液用两层 No. 1 filter paper过滤，4ml 分装，-80℃ 低温保存（液氮或低温冰箱）。 2 萜类合酶分析 TPS Enzyme Assays 37℃解冻蛋白质提取液，加入萜合酶缓冲液：mono-TPS buffer（25 mm HEPES羟乙基哌嗪乙磺酸, pH 7.5; 5 mm DTT; 10%[v/v] 甘油; 1 mm MnCl2; and 100 mm KCl），sesqui-TPS buffer (25 mm HEPES, pH 7.3; 10 mm MgCl2; 10 mm DTT; and 10% [v/v] glycerol), or di-TPS buffer (30 mm HEPES, pH 7.2; 7.5 mm MgCl2; 20 m MnCl2; 5% [v/v]glycerol; and 5 mm DTT). 取1ml对酶活性进行测定，加入底物10 uM (with 1 u Ci 3H-GPP) for mono-TPS activities, or 10 um GGPP (0.5 uCi 3H-GGPP) as substrate for di-TPS assays. 所有的测定都设置重复，加入1 ml戊烷混合收集挥发物质，30℃静置1.5 h，迅速冷冻终止酶活，解冻后涡旋混合，2500转离心2 min，用0.4 g硅胶过滤，与0.6 g硫酸镁混合，去除非目标水解产物，GC-MS分析。 这个方法是国外做大冷杉和挪威云杉的方法，暂不知道国内现在谁做过，请各位虫虫提提意见，谢谢啦！ [ Last edited by seelem on 2010-3-19 at 17:04 ] |
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