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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】提取瘤胃宏基因组DNA，如何避免提到植物的DNA
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 段家一凡 的 9 个金币

段家一凡

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-03-16 15:16:14:
通用引物也不是微生物 植物都通用啊。。。 微生物总有测出来过的。 设计应该也不难吧。

怎么都回答测序的问题呢，测序还不是我关心的主要问题。这问题回答的偏离目标了，但也非常感谢参与。基因组测序没有谁设计引物来测序的，除非是后面来验证基因组序列拼接的对不对，才会设计特异引物来PCR扩增看实际的片段大小与拼接的大小是否相符。另外通用引物是载体的序列，与外援DNA的来源是没有相关的，不然基因组怎么测序啊，微生物和植物测序的策略都是一样的，只是测序的量的多少。我感觉你还没理解我的问题。请再给我想想办法。
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11楼2010-03-16 17:43:14
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段家一凡

木虫 (正式写手)
继续等待
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12楼2010-03-17 11:57:01
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2): 2010-03-17 12:36
段家一凡(金币+3): 2010-03-17 13:42
引用回帖:
Originally posted by 段家一凡 at 2010-03-16 14:42:57:

我不是克隆或测序某一个微生物的某一个特别的基因，所以应该不用特异的PCR，也就没有你所说的该步骤了。基因组测序也不需要设计特别的引物的，都是用通用引物来测，这点我也是知道的。宏基因组是对未培养微生物 ...

照你这么说植物基因组测出来之后岂不是不一定能分辨出来吗？我觉得好像还是不对，据我所知，是用特殊的方法获得细菌的基因组后测序的

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-17 at 12:20 ]
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13楼2010-03-17 12:17:09
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段家一凡

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-17 12:17:09:

照你这么说植物基因组测出来之后岂不是不一定能分辨出来吗？我觉得好像还是不对，据我所知，是用特殊的方法获得细菌的基因组后测序的

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-17 at 12:20 ]

对了，我就是想知道用什么特殊的方法宏环境样品中获得细菌的基因组。如果植物和微生物的基因组同时测，植物的基因组可以分辨的出来，通过Blast就可以了，但最好是已测过的基因组，如水稻，但这样太浪费了，假设我测了10G的宏基因组序列，有一半是我不需要的植物DNA序列，那不可亏大了，另外基因注释也很麻烦了。你可以想象一下，如果你测某一个具体的微生物的基因组，你的DNA样品被污染了，混有了其他的微生物的DNA，而且比较多，那么你测出来的结果就完蛋了。
我查了也没有什么特殊的办法只是选择性的裂解微生物的细胞，不知你能否提供一下信息的来源，先谢谢了。
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14楼2010-03-17 12:49:02
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 11:01
我们实验室提取过底泥微生物的宏基因组，但是他们是用来进一步做DGGE分析，对16s rRNA进行PCR，然后仅对V3区进行测序，所以不需要分离微生物基因组，你的实验我大概明白意思了，我想可以通过脉冲场电泳技术将细菌基因组和植物基因组先分开，具体你参照一下这个人硕士论文：朱雅新《荷斯坦奶牛瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析》，应该可以在中国知网上下载，我在国外，没有帐号
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15楼2010-03-17 15:30:36
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jiangcj0520

铁杆木虫 (正式写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-14 11:01
,
我想，这个宏基因组测序比较花钱咧；
动不动就是10G，
现在很流行搞链霉菌或者真菌的测序；基因组很小，一般做的是在5到10M左右；
我觉得还是搞单个新型酶基因的功能研究吧，
先弄完手上的新酶基因再说。
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NOPAINS,NOGAINS.
16楼2010-03-17 15:37:15
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lcat

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
段家一凡(金币+5):好建议 2010-03-19 00:17
scelab(金币+5):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-14 11:01
好多朋友的回答答非所问啊，可能或是不了解宏基因组测序的目的，以为只是想钓某个基因啊、鉴定菌种组成啊什么的，或是不了解DNA测序只认序列不区分物种的特点，我自己的看法是：
1. 虽然没做过实验，我倒觉得基因组提取时不一定会提到大量植物基因组，要是方便的话做个单酶切连接转化，测几十个菌看看比例到底是多少。
2. 很多人用的都是瘤胃液、固形物浸出液，可以去掉粗纤维等，好像是解决了这个问题了，我觉得可能会损失掉吸附性强的菌体，还有进入纤维内的菌也可能出不来，可能会丢失基因资源吧。
3. 我能想到的办法，一个是用过量纤维素酶水解样品，尽量降解植物细胞壁使内容物释放，然后多次洗涤再提取基因组。再一个就是一种设想了，反正植物RNA都降解了，如果我们只是要基因序列的话，是不是可以直接提取样品的总RNA送测序公司纯化mRNA后做宏转录组。不过固形物提取RNA可能在量上不易达到要求，还要求样品必须绝对新鲜，不太容易做到。
大家多发表意见啊。。。
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17楼2010-03-18 18:06:07
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段家一凡

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lcat at 2010-03-18 18:06:07:
好多朋友的回答答非所问啊，可能或是不了解宏基因组测序的目的，以为只是想钓某个基因啊、鉴定菌种组成啊什么的，或是不了解DNA测序只认序列不区分物种的特点，我自己的看法是：
1. 虽然没做过实验，我倒觉得基因 ...

终于遇到了小同行了。据我所知华大在测熊猫的肠道微生物的时候，确实测到了很多竹的基因组DNA，而且量还是很多的，这是一种浪费，而且对后期的宏基因组的基因的注释也是很麻烦的。所以你提到的建议先测一点看看，倒也是比较好的方法。另华大刚报道了人的肠道的宏基因组的测序，达到500G，量应该是所有报导里面最大的了，但是好像没有公布提取的方法，提取的方法引用的一篇文献，该文献也没有介绍方法，基因组的提取只是一句带过，真奇怪，然道该方法需要保密，不介绍方法，这文章怎么可以也能发出来呢，可能他们已经解决了如何去掉或防止污染的植物DNA的方法，不知有谁知道他们所用的详细的方法。
关于瘤胃微生物，针对于植物细胞壁的降解来说的，一般认为与食物紧密结合的微生物才是重要的部分，瘤胃液部分倒不是很重要，所以要解决的问题还是如何从混合物中特异提取微生物的DNA问题。关于你说的纤维素酶的处理，可能也是一个思路，但植物细胞壁含有很多的其他多糖，可能还需添加其他的糖基水解酶类才行，可以尝试。
关于宏cDNA的测序，那可能是下一步的打算，毕竟细菌还是在瘤胃纤维素的降解起主导作用，宏cDNA侧重点还是真菌的方面。非常感谢提到建议，请继续探讨。
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18楼2010-03-19 00:43:16
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cnlics

木虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 11:01
完全避免植物DNA似乎不可能。植物DNA也会降解，用脉冲场电泳也无法分离植物DNA，还会丢掉相对数量较少的菌种的DNA。

也许，可以使用两种不同的过滤方法可以减少植物DNA的干扰。

这个想少花钱多办事的想法很有难度。
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19楼2010-04-14 09:28:43
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