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段家一凡

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-03-16 15:16:14:
通用引物也不是微生物 植物都通用啊。。。 微生物总有测出来过的。 设计应该也不难吧。

怎么都回答测序的问题呢,测序还不是我关心的主要问题。这问题回答的偏离目标了,但也非常感谢参与。基因组测序没有谁设计引物来测序的,除非是后面来验证基因组序列拼接的对不对,才会设计特异引物来PCR扩增看实际的片段大小与拼接的大小是否相符。另外通用引物是载体的序列,与外援DNA的来源是没有相关的,不然基因组怎么测序啊,微生物和植物测序的策略都是一样的,只是测序的量的多少。我感觉你还没理解我的问题。请再给我想想办法。
11楼2010-03-16 17:43:14
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段家一凡

木虫 (正式写手)

继续等待
12楼2010-03-17 11:57:01
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
amisking(金币+2): 2010-03-17 12:36
段家一凡(金币+3): 2010-03-17 13:42
引用回帖:
Originally posted by 段家一凡 at 2010-03-16 14:42:57:

我不是克隆或测序某一个微生物的某一个特别的基因,所以应该不用特异的PCR,也就没有你所说的该步骤了。基因组测序也不需要设计特别的引物的,都是用通用引物来测,这点我也是知道的。宏基因组是对未培养微生物 ...

照你这么说植物基因组测出来之后岂不是不一定能分辨出来吗?我觉得好像还是不对,据我所知,是用特殊的方法获得细菌的基因组后测序的

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-17 at 12:20 ]
13楼2010-03-17 12:17:09
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段家一凡

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-03-17 12:17:09:

照你这么说植物基因组测出来之后岂不是不一定能分辨出来吗?我觉得好像还是不对,据我所知,是用特殊的方法获得细菌的基因组后测序的

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-17 at 12:20 ]

对了,我就是想知道用什么特殊的方法宏环境样品中获得细菌的基因组。如果植物和微生物的基因组同时测,植物的基因组可以分辨的出来,通过Blast就可以了,但最好是已测过的基因组,如水稻,但这样太浪费了,假设我测了10G的宏基因组序列,有一半是我不需要的植物DNA序列,那不可亏大了,另外基因注释也很麻烦了。你可以想象一下,如果你测某一个具体的微生物的基因组,你的DNA样品被污染了,混有了其他的微生物的DNA,而且比较多,那么你测出来的结果就完蛋了。
我查了也没有什么特殊的办法只是选择性的裂解微生物的细胞,不知你能否提供一下信息的来源,先谢谢了。
14楼2010-03-17 12:49:02
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


scelab(金币+1):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 11:01
我们实验室提取过底泥微生物的宏基因组,但是他们是用来进一步做DGGE分析,对16s rRNA进行PCR,然后仅对V3区进行测序,所以不需要分离微生物基因组,你的实验我大概明白意思了,我想可以通过脉冲场电泳技术将细菌基因组和植物基因组先分开,具体你参照一下这个人硕士论文:朱雅新《荷斯坦奶牛瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析》,应该可以在中国知网上下载,我在国外,没有帐号
15楼2010-03-17 15:30:36
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jiangcj0520

铁杆木虫 (正式写手)


scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-14 11:01
,
我想,这个宏基因组测序比较花钱咧;
动不动就是10G,
现在很流行搞链霉菌或者真菌的测序;基因组很小,一般做的是在5到10M左右;
我觉得还是搞单个新型酶基因的功能研究吧,
先弄完手上的新酶基因再说。
NOPAINS,NOGAINS.
16楼2010-03-17 15:37:15
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lcat

木虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★
段家一凡(金币+5):好建议 2010-03-19 00:17
scelab(金币+5):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-14 11:01
好多朋友的回答答非所问啊,可能或是不了解宏基因组测序的目的,以为只是想钓某个基因啊、鉴定菌种组成啊什么的,或是不了解DNA测序只认序列不区分物种的特点,我自己的看法是:
1. 虽然没做过实验,我倒觉得基因组提取时不一定会提到大量植物基因组,要是方便的话做个单酶切连接转化,测几十个菌看看比例到底是多少。
2. 很多人用的都是瘤胃液、固形物浸出液,可以去掉粗纤维等,好像是解决了这个问题了,我觉得可能会损失掉吸附性强的菌体,还有进入纤维内的菌也可能出不来,可能会丢失基因资源吧。
3. 我能想到的办法,一个是用过量纤维素酶水解样品,尽量降解植物细胞壁使内容物释放,然后多次洗涤再提取基因组。再一个就是一种设想了,反正植物RNA都降解了,如果我们只是要基因序列的话,是不是可以直接提取样品的总RNA送测序公司纯化mRNA后做宏转录组。不过固形物提取RNA可能在量上不易达到要求,还要求样品必须绝对新鲜,不太容易做到。
大家多发表意见啊。。。
17楼2010-03-18 18:06:07
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段家一凡

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lcat at 2010-03-18 18:06:07:
好多朋友的回答答非所问啊,可能或是不了解宏基因组测序的目的,以为只是想钓某个基因啊、鉴定菌种组成啊什么的,或是不了解DNA测序只认序列不区分物种的特点,我自己的看法是:
1. 虽然没做过实验,我倒觉得基因 ...

终于遇到了小同行了。据我所知华大在测熊猫的肠道微生物的时候,确实测到了很多竹的基因组DNA,而且量还是很多的,这是一种浪费,而且对后期的宏基因组的基因的注释也是很麻烦的。所以你提到的建议先测一点看看,倒也是比较好的方法。另华大刚报道了人的肠道的宏基因组的测序,达到500G,量应该是所有报导里面最大的了,但是好像没有公布提取的方法,提取的方法引用的一篇文献,该文献也没有介绍方法,基因组的提取只是一句带过,真奇怪,然道该方法需要保密,不介绍方法,这文章怎么可以也能发出来呢,可能他们已经解决了如何去掉或防止污染的植物DNA的方法,不知有谁知道他们所用的详细的方法。
关于瘤胃微生物,针对于植物细胞壁的降解来说的,一般认为与食物紧密结合的微生物才是重要的部分,瘤胃液部分倒不是很重要,所以要解决的问题还是如何从混合物中特异提取微生物的DNA问题。关于你说的纤维素酶的处理,可能也是一个思路,但植物细胞壁含有很多的其他多糖,可能还需添加其他的糖基水解酶类才行,可以尝试。
关于宏cDNA的测序,那可能是下一步的打算,毕竟细菌还是在瘤胃纤维素的降解起主导作用,宏cDNA侧重点还是真菌的方面。非常感谢提到建议,请继续探讨。
18楼2010-03-19 00:43:16
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cnlics

木虫 (小有名气)

★ ★
scelab(金币+2):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-14 11:01
完全避免植物DNA似乎不可能。植物DNA也会降解,用脉冲场电泳也无法分离植物DNA,还会丢掉相对数量较少的菌种的DNA。

也许,可以使用两种不同的过滤方法可以减少植物DNA的干扰。

这个想少花钱多办事的想法很有难度。
19楼2010-04-14 09:28:43
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