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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物连接不上，没法测序
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z320m320

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物连接不上，没法测序

我的目的片段大小3kb左右，提取全基因PCR得到产物纯化，开始用的TaKaRa
的pMD19-T 连了八次没连接上，现在又换了Transgen 的pEASY-T3 做了一次也没连上，我现在很迷惑，恳请高手指点迷津，谢谢！
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1楼 2010-03-15 10:13:09
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hfztim

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1): 2010-03-15 11:22
确定P出来了吗？试一下直接用P出来的产物加乙醇沉淀、溶解，再连一下。
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2楼2010-03-15 10:24:19
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tracy007

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是酶切的不好呢
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3楼2010-03-15 10:27:14
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z320m320

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by z320m320 at 2010-03-15 10:13:09:
我的目的片段大小3kb左右，提取全基因PCR得到产物纯化，开始用的TaKaRa
的pMD19-T 连了八次没连接上，现在又换了Transgen 的pEASY-T3 做了一次也没连上，我现在很迷惑，恳请高手指点迷津，谢谢！

p出来了，条带很清晰，就是连不上
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4楼2010-03-15 10:32:55
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
4度连过夜吧
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5楼2010-03-15 12:04:13
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-03-15 12:25
用的什么Taq扩的啊，不会是两边不带A吧。这样你连T载体肯定连不上啊。
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6楼2010-03-15 12:23:53
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j2

木虫 (正式写手)
连接的pmol比例不对？
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
7楼2010-03-15 12:51:49
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 微笑漩涡 at 2010-03-15 12:23:53:
用的什么Taq扩的啊，不会是两边不带A吧。这样你连T载体肯定连不上啊。

我觉得这个有道理，看一下酶
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8楼2010-03-15 13:44:19
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biodadiao

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该不会吧，一般AT克隆，只要PCR产物纯化后，16度连接30min就可以了，若实在连不上的话，可以将PCR产物添加dATP反应一会时间，效果会更好。

提醒一下，你的PCR实用的是Taq酶吧，不是pfu吧？
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9楼2010-03-15 16:40:53
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果只是为了测序，PCR产物纯化后也可以。
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10楼2010-03-15 22:51:26
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