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z320m320

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物连接不上,没法测序

我的目的片段大小3kb左右,提取全基因PCR得到产物纯化,开始用的TaKaRa
的pMD19-T 连了八次没连接上,现在又换了Transgen 的pEASY-T3 做了一次也没连上,我现在很迷惑,恳请高手指点迷津,谢谢!
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hfztim

至尊木虫 (正式写手)

★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-03-15 11:22
确定P出来了吗?试一下直接用P出来的产物加乙醇沉淀、溶解,再连一下。
2楼2010-03-15 10:24:19
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tracy007

木虫 (正式写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
是不是酶切的不好呢
3楼2010-03-15 10:27:14
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z320m320

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by z320m320 at 2010-03-15 10:13:09:
我的目的片段大小3kb左右,提取全基因PCR得到产物纯化,开始用的TaKaRa
的pMD19-T 连了八次没连接上,现在又换了Transgen 的pEASY-T3 做了一次也没连上,我现在很迷惑,恳请高手指点迷津,谢谢!

p出来了,条带很清晰,就是连不上
4楼2010-03-15 10:32:55
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

4度连过夜吧
5楼2010-03-15 12:04:13
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 2010-03-15 12:25
用的什么Taq扩的啊,不会是两边不带A吧。这样你连T载体肯定连不上啊。
6楼2010-03-15 12:23:53
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j2

木虫 (正式写手)

连接的pmol比例不对?
修炼ing,当虫仙……
7楼2010-03-15 12:51:49
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 微笑漩涡 at 2010-03-15 12:23:53:
用的什么Taq扩的啊,不会是两边不带A吧。这样你连T载体肯定连不上啊。

我觉得这个有道理,看一下酶
8楼2010-03-15 13:44:19
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biodadiao

铜虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
应该不会吧,一般AT克隆,只要PCR产物纯化后,16度连接30min就可以了,若实在连不上的话,可以将PCR产物添加dATP反应一会时间,效果会更好。

提醒一下,你的PCR实用的是Taq酶吧,不是pfu吧?
9楼2010-03-15 16:40:53
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果只是为了测序,PCR产物纯化后也可以。
10楼2010-03-15 22:51:26
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