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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】单酶切可以切开，双酶切却切不开
汕头大学海洋科学接受调剂
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yghboy168

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】单酶切可以切开，双酶切却切不开

我在宝生物的pTA2,T载体上链接一个5KB的片段。用XbaI 或NdeI单酶切，都可以切开，而且片段大小显示连接上了目的片段。但是双酶切却一直切不开。分步双酶切也不行（单酶切后，切胶回收，再用另一酶单酶切）。
请教大家为什么？
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眼内有尘三界窄，心头无事一床宽！
1楼 2010-03-14 19:44:08
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Charlie1331

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
LZ有没有注意到两个酶的Buffer一不一样啊？还有酶切温度什么的……
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2楼2010-03-14 20:00:17
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
用宝生物的酶曾经出现过一模一样的情况。如果仅仅是鉴定的话，实在不行，用旁边的酶切切看。
另外用T载特异性引物去测序，看看酶切位点是否突变了。
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Thank-you，so-blue.
3楼2010-03-14 20:39:36
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
单酶切都能切开双酶切切不开，这种可能性不可能啊，你咋知道你单酶切的时候都能切开啊，个人觉得单酶切虽然成一条直线但不好说是能切开的，我觉得可能XbaI 或NdeI中有一种酶且为点是不是突变了----
    建议你改用载体上的另外一个酶切位点（很容易切开的位点）和XbaI 或NdeI分别酶切，验证一下是否XbaI 或NdeI都能切开---
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-03-15 10:47:59
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
对，2个酶的BUFFER不一样，要同时切的话只能选一个酶，有一个表的，哪两个酶同时切用什么酶上面都有列出来了，我不记得是哪个公司的说明书了。
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
5楼2010-03-15 10:57:29
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
单切的效果比同时切的效果好，就是你如果要双切的话，先用一个酶切，切好后再用另外一个酶切
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
6楼2010-03-15 10:59:03
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
刚才在4楼说错了一个字，现在改一下，哪两个酶同时切用什么  buffer  上面都有列出来了，我不记得是哪个公司的说明书了。
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
7楼2010-03-15 11:00:28
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
是5楼，看错了哦，不好意思
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
8楼2010-03-15 11:01:15
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
双酶切一定要注意酶切buffer，买内切酶的公司都会有说明，你问一下技术
另外分别单酶切的时候，可以将两个酶先后顺序调换一下看看，这种做法是有很大区别的
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9楼2010-03-15 12:01:56
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