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yghboy168

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】单酶切可以切开,双酶切却切不开

我在宝生物的pTA2,T载体上链接一个5KB的片段。用XbaI 或NdeI单酶切,都可以切开,而且片段大小显示连接上了目的片段。但是双酶切却一直切不开。分步双酶切也不行(单酶切后,切胶回收,再用另一酶单酶切)。
请教大家为什么?
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眼内有尘三界窄,心头无事一床宽!
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Charlie1331

金虫 (正式写手)


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LZ有没有注意到两个酶的Buffer一不一样啊?还有酶切温度什么的……
2楼2010-03-14 20:00:17
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

用宝生物的酶曾经出现过一模一样的情况。如果仅仅是鉴定的话,实在不行,用旁边的酶切切看。
另外用T载特异性引物去测序,看看酶切位点是否突变了。
Thank-you,so-blue.
3楼2010-03-14 20:39:36
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


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单酶切都能切开双酶切切不开,这种可能性不可能啊,你咋知道你单酶切的时候都能切开啊,个人觉得单酶切虽然成一条直线但不好说是能切开的,我觉得可能XbaI 或NdeI中有一种酶且为点是不是突变了----
    建议你改用载体上的另外一个酶切位点(很容易切开的位点)和XbaI 或NdeI分别酶切,验证一下是否XbaI 或NdeI都能切开---
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-03-15 10:47:59
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)


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对,2个酶的BUFFER不一样,要同时切的话只能选一个酶,有一个表的,哪两个酶同时切用什么酶上面都有列出来了,我不记得是哪个公司的说明书了。
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
5楼2010-03-15 10:57:29
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

单切的效果比同时切的效果好,就是你如果要双切的话,先用一个酶切,切好后再用另外一个酶切
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
6楼2010-03-15 10:59:03
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)


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刚才在4楼说错了一个字,现在改一下,哪两个酶同时切用什么  buffer  上面都有列出来了,我不记得是哪个公司的说明书了。
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
7楼2010-03-15 11:00:28
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

是5楼,看错了哦,不好意思
不知道什么是生活了,也不知道生活是什么了
8楼2010-03-15 11:01:15
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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双酶切一定要注意酶切buffer,买内切酶的公司都会有说明,你问一下技术
另外分别单酶切的时候,可以将两个酶先后顺序调换一下看看,这种做法是有很大区别的
9楼2010-03-15 12:01:56
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