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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » 【求助】毛细管电泳和液相方面的
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zhujiren

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助】毛细管电泳和液相方面的

我现在正在做的课题是酶催化蛋白和果胶之间的反应，希望两者能够通过共价键结合起来。所以选择了毛细管电泳作为分析检测手段。蛋白用的是酪蛋白，分子量6000多，果胶也是多聚物，分子量也在2-3万。第一次用的时候，选择的是CE自由区带柱（我自己觉得是，因为是裸管直接跑电泳），运行缓冲液和电极缓冲液我都用的是硼酸-Tris-EDTA，PH9.5，75um/60cm柱,不知道这个缓冲液体系以及CE分离模式适不适合分离蛋白与果胶以及他们的反应产物，还怎么改进？做了一次发现很不稳定，同一样品前后两次差很多。不知道是不是仪器刚开始不稳定，需要跑几个样才能稳定。
     还有我之前也用过SDS-PAGE电泳，但是总是不理想，现在想试试HPLC或者凝胶色谱法，根据我的样品及实验目的（就是想证明蛋白-果胶能够共价链接，分子量有显著变化），看有什么样的凝胶色谱条件比较合适。真诚恳求高人指点，助人为乐嘛。方便的话把意见发我邮箱：shenlong1000@gmail.com
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1楼 2010-03-12 14:23:45
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platto

木虫 (著名写手)

一窍不通
★ ★ ★ ★
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佳怡(金币+3):3Q~ 2010-03-12 18:52
蛋白质非常容易在裸管上发生吸附等行为的，由此造成重现性差，稳定性差等问题；解决办法有几种，最好选用商品化的蛋白质分析毛细管，再就是自己制备可以消除蛋白质在毛细管内壁吸附的毛细管，如线性丙烯酰胺凝胶毛细管；如果你分析的蛋白质分子量不是很大，可以使用较高浓度，且富含氨基的buffer，但这个方法虽然操作简便，但效果也较差。
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七窍通了六窍
2楼2010-03-12 14:54:24
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zhujiren

新虫 (小有名气)
那我选择凝胶色谱行吗？或者在毛细管电泳缓冲液中添加其他的添加剂，减少吸附？
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3楼2010-03-12 15:28:12
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patent000

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以选择凝胶柱，有专门用来测分子量的HPLC凝胶柱，你可以问一下
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4楼2010-03-12 15:34:05
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zhujiren

新虫 (小有名气)
谢谢高人！
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5楼2010-03-12 20:19:33
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platto

木虫 (著名写手)

一窍不通
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果你想用CE加入添加剂来分离分析的话，你要考虑一下你的蛋白质是否会变性，以及变性后对你的分析有无影响
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七窍通了六窍
6楼2010-03-14 11:34:12
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zhujiren

新虫 (小有名气)
我的反应体系里就一种蛋白和一种果胶，可能会有反应产物，所以蛋白变性影响应该不大吧？我想问问，分离蛋白与果胶用硼酸—tris（PH9.5及以上）的缓冲液有效吗？有人建议我换柱子，不用裸管（避免蛋白吸附），你觉得有必要吗？因为我主要是想看看有没有反应，通过分子量看的话应该会很直观，您看凝胶色谱有效吗？凝胶色谱是指一般的柱色谱（灌特定凝胶，如葡聚糖），还是HPLC中的凝胶色谱？谢谢解答！
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7楼2010-03-14 13:37:41
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