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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】到底问题出在哪？
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准博士

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】到底问题出在哪？

最近开始做一个关键酶的基因，本来16s rDNA鉴定出来与一个菌的同源性有98％
，并且我们的目的产物是同一个家族的高分子多糖。我就用的那个已经菌的已经酶的基因设计的引物，想直接钓基因。可是，重复了几次实验，特异性都不强，条带很多，目的条带很淡，甚至没有，也调整了模板的浓度，引物的浓度，还有退火温度，还是不行啊，急啊，等着毕业。
想请教大家：
（1)同源性98％的菌可不可以这样设计引物，我之前也用过简并引物的方法，但是没有扩到过想要的东西，那个实验做了半年，没有出来想要的片段
（2)这个学期刚刚开始，菌种鉴定，然后设计基因，怎么还是扩不出东西来？
（3)一个很简单的最基本的分子实验，怎么到我这就这么难啊？
  难道是我的基因组的问题？还是其它的原因，我真是无语了。请高人指点
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1楼 2010-03-12 14:12:55
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
准博士(金币+1): 2010-03-15 22:30
准博士(金币+1): 2010-03-15 22:31
同源性98%，肯定没有必要设计简并引物了，如果一对引物扩增不出来，我觉得可以再设计一对试试，同时，可以将引物组合起来，跑巢式PCR，可以增加特异性，一般巢式PCR出来的可能性非常大
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2楼2010-03-12 17:06:08
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mxbeaver

木虫 (著名写手)

浪滔滔~人渺渺~
准博士(金币+2): 2010-03-15 22:30
16s rDNA的同源性98％，并不算高。同一个属的菌99%或100%都有。
“目的产物是同一个家族的高分子多糖”是菌所产的酶的产物？即使作用底物和产物一样，酶也有可能是不同的两个酶
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3楼2010-03-13 10:35:02
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xhy0016

金虫 (小有名气)
准博士(金币+2): 2010-03-15 22:30
我觉得同源性是很高，但是基因都是有特异性的，引物同样如此。如果这个引物对其他的非目的基因的特异性更强，那么，你就不可能得到足够的目的基因。建议你还是去再设计一个引物，毕竟快毕业了嘛。祝你顺利毕业！
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4楼2010-03-14 14:19:06
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love_st

金虫 (著名写手)
准博士(金币+1): 2010-03-15 22:30
是不是你的引物错配的比较严重？
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5楼2010-03-14 14:59:33
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biodadiao

铜虫 (小有名气)
准博士(金币+1): 2010-03-15 22:30
菌属相近的，基因并不一定类似，所以PCR产物没有是正常的，建议不要继续批下去了，采用基因文库法来做可能能得到结果，就是工作量较大些。
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6楼2010-03-15 16:35:13
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