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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切效果不好
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arniekyo

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切效果不好

我最近用了fermentas公司的酶Xho1和Mlu1双酶切我的载体。载体上连接有我的目的基因，已经测序完全正确，但是用着两个酶进行双酶切的时候，切出来的电泳检测，全切散了，看不到带的迹象。50ul，25ul的体系都做过了，酶切时间也从8-14小时不等，但是结果还是很不好，希望能给出指点
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1楼 2010-03-10 14:50:05
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
建议你上个图看看
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2楼2010-03-10 15:46:12
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
会不会时间太长了些
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3楼2010-03-10 15:58:20
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漫迹

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1): 2010-03-10 18:23
要是有拖尾现象的话，那就可能是切得时间太长了
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4楼2010-03-10 16:07:46
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 2010-03-10 18:23
切弥散我们实验室也经常出现这个问题，可能是酶的原因，也可能是质粒提取的不好。
建议换旁边的酶切切看，看是否有弥散。
另外提质粒的时候，洗脱前建议让残留乙醇尽量挥发干净（我们的做法是烘箱敞口烘5-10 min）。
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Thank-you，so-blue.
5楼2010-03-10 16:14:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
………………切那么长时间……降解了吧，或者星活性
我最长都没有切超过3h
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6楼2010-03-10 18:21:25
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Charlie1331

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
第一，目的基因内部有没有再次确认过无上述两种酶切位点；第二，这两种酶不是很常用，有没有注意到其最适温度？第三，时间是长了点……一般3-5h差不多了。
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7楼2010-03-10 22:41:16
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特洛伊

金虫 (小有名气)
同意7楼的观点
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成本
8楼2010-03-11 10:21:52
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arniekyo

铜虫 (小有名气)
这个问题已经解决了，我把酶的用量，酶切时间减少了一些，效果很好。谢谢大家
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9楼2010-03-16 11:03:15
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