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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】测序，T7引物套峰问题
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】测序，T7引物套峰问题

PGEM T-easy载体测序，为什么只有SP6引物的结果好，T7引物为什么套峰严重，公司自己测了两次，结果都差不多，存在严重套峰现象。另外，TOPO载体的也试了，M13F引物也不存在问题，T7引物也不行。换引物会不会有效，PGEM T-easy载体，大家都用什么引物测序？

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-3-9 at 16:59 ]
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1楼 2010-03-08 21:36:39
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
自己顶一下
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2楼2010-03-09 08:45:19
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van0735

铁杆木虫 (小有名气)
yujiaping1(金币+2): 2010-03-09 16:59
我以前也用过SP6和T7，发现T7不如SP6效率高，建议楼主把T7换成T3试试，如果还是不行，就将目的序列一正一反插到载体中，都用SP6测序，祝你成功！
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3楼2010-03-09 09:28:01
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by van0735 at 2010-03-09 09:28:01:
我以前也用过SP6和T7，发现T7不如SP6效率高，建议楼主把T7换成T3试试，如果还是不行，就将目的序列一正一反插到载体中，都用SP6测序，祝你成功！

请问如何将目的序列反过来插进去，我们都是随机插的，有正的，有反的，好像正的多一些，不知道如何才能控制正反
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4楼2010-03-09 17:01:21
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by van0735 at 2010-03-09 09:28:01:
我以前也用过SP6和T7，发现T7不如SP6效率高，建议楼主把T7换成T3试试，如果还是不行，就将目的序列一正一反插到载体中，都用SP6测序，祝你成功！

TOPO载体没有T3区
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5楼2010-03-09 19:21:09
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van0735

铁杆木虫 (小有名气)
yujiaping1(金币+1):谢谢，看来这个要碰运气 2010-03-11 13:13
插入的正反顺序的确不好控制，但是可以多挑几个单克隆送测序，肯定会有正向插入也有反向插入的，因为这个毕竟不是小概率事件，以前我做的时候一般送4个克隆，至少有一个是反向插入的，我想楼主的运气应该不会差，呵呵，祝好运！
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6楼2010-03-11 08:40:14
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
yujiaping1(金币+1):谢谢，换了个M13F，公司正在给测 2010-03-11 13:12
yujiaping1(金币+1): 2010-03-12 22:08
既然T7不好用，为什么非要用T7呢？M13F、M13R不都可以吗？
有可能T7跟你的插入片段上某处有退火
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
7楼2010-03-11 13:10:42
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
问题已经解决，谢谢大家，用M13R引物，不存在套峰了，结果很漂亮
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8楼2010-03-12 22:08:24
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