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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】经验求助
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森林7631

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】经验求助

请教各位一个问题，我有一株真菌，想扩一个酶基因，但在网上还未有真菌中这个酶基因的报道，只有细菌和放线菌中有这个酶基因的报道，我现在应该依据什么去设计引物，怎么去做，请给位指教，谢谢！
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Time lost can not be recalled.
1楼 2010-03-06 15:42:02
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yanfeier
1949stone:解决问题的沙发 才是好沙发 2010-03-06 20:45
顶一下。。。
2楼2010-03-06 16:00:33
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+2): 2010-03-07 16:16
根据细菌和放线菌的基因设计同源引物（可以根据同源性大小，考虑是否需要设计简并引物，能不用简并引物，最好不用），得到扩增片段后，克隆测序，然后设计两端的RACE引物，获得两端序列，拼接得到全长基因。
如果基因足够短，1000bp左右或者更小，可以直接设计RACE引物，克隆测序拼接。

你这里存在的问题是：细菌和放线菌都是原核生物，和真菌的差异可能会很大，究竟有多少同源性，很难讲，建议你再查查相关真核生物该基因的研究进展
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3楼2010-03-06 21:56:35
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85715623

木虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-03-07 16:16
据说可以先得到蛋白，再反推核酸，克隆。
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4楼2010-03-07 10:28:09
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)
一般的按照2楼的做法，三楼的做法很难做，不是那么好推，因为氨基酸有间并型，希望对你有所帮助
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将有能量帮助他人作为自己的人生追求！
5楼2010-03-07 16:12:23
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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诱导酶的表达，提取菌体总RNA逆转录，最后得到基因
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2010-03-07 16:53:27
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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如果要纯化蛋白质，那么按照蛋白质测序的要求，要达到一定的量和纯度就必须多次纯化，包括各种纯化路线设计、试剂选择、条件摸索，极其费时。退一万步，密码子的兼并性也是个问题，可以说如果仅这样是绝对绝对不能获得菌体里的基因的，总有偏差。这是最差的路线。

设计引物，面临同源性底下，无功而返的危险，不过也有极少可能性一下子成功。

提取RNA还是值得一试的，有可能一下子获得全长，这个可能性是三种路线中最大的。个人见解，而且推荐此法。
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7楼2010-03-07 16:59:38
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森林7631

铜虫 (小有名气)
谢谢大家的建议，我年前做的就是2楼朋友说的那种方法，根据细菌和真菌中报道的酶基因设计普通引物和简并引物，但扩增结果不理想，上下游引物可以在测序结果中找到，但是翻译成蛋白质后中间有好多终止（stop）。6楼朋友的三种分析很详细，很感谢你！
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Time lost can not be recalled.
8楼2010-03-08 10:15:41
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