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森林7631

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】经验求助

请教各位一个问题,我有一株真菌,想扩一个酶基因,但在网上还未有真菌中这个酶基因的报道,只有细菌和放线菌中有这个酶基因的报道,我现在应该依据什么去设计引物,怎么去做,请给位指教,谢谢!
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1949stone:解决问题的沙发 才是好沙发 2010-03-06 20:45
顶一下。。。
2楼2010-03-06 16:00:33
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+2): 2010-03-07 16:16
根据细菌和放线菌的基因设计同源引物(可以根据同源性大小,考虑是否需要设计简并引物,能不用简并引物,最好不用),得到扩增片段后,克隆测序,然后设计两端的RACE引物,获得两端序列,拼接得到全长基因。
如果基因足够短,1000bp左右或者更小,可以直接设计RACE引物,克隆测序拼接。

你这里存在的问题是:细菌和放线菌都是原核生物,和真菌的差异可能会很大,究竟有多少同源性,很难讲,建议你再查查相关真核生物该基因的研究进展
3楼2010-03-06 21:56:35
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85715623

木虫 (正式写手)

★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-03-07 16:16
据说可以先得到蛋白,再反推核酸,克隆。
4楼2010-03-07 10:28:09
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)

一般的按照2楼的做法,三楼的做法很难做,不是那么好推,因为氨基酸有间并型,希望对你有所帮助
将有能量帮助他人作为自己的人生追求!
5楼2010-03-07 16:12:23
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶


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诱导酶的表达,提取菌体总RNA逆转录,最后得到基因
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2010-03-07 16:53:27
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶


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如果要纯化蛋白质,那么按照蛋白质测序的要求,要达到一定的量和纯度就必须多次纯化,包括各种纯化路线设计、试剂选择、条件摸索,极其费时。退一万步,密码子的兼并性也是个问题,可以说如果仅这样是绝对绝对不能获得菌体里的基因的,总有偏差。这是最差的路线。

设计引物,面临同源性底下,无功而返的危险,不过也有极少可能性一下子成功。

提取RNA还是值得一试的,有可能一下子获得全长,这个可能性是三种路线中最大的。个人见解,而且推荐此法。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2010-03-07 16:59:38
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森林7631

铜虫 (小有名气)

谢谢大家的建议,我年前做的就是2楼朋友说的那种方法,根据细菌和真菌中报道的酶基因设计普通引物和简并引物,但扩增结果不理想,上下游引物可以在测序结果中找到,但是翻译成蛋白质后中间有好多终止(stop)。6楼朋友的三种分析很详细,很感谢你!
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8楼2010-03-08 10:15:41
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