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xiangao金虫 (正式写手)
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【求助/交流】枯草芽孢杆菌WB800感受态的制备
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请大家发我一份B.subtilis WB800感受态的制备方法，我现在转化效率很低。 谢谢帮忙！ |
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xiangao
金虫 (正式写手)
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2楼2010-03-06 16:47:18
zhuifeng7000
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xiangao(金币+5):谢谢应助 2010-03-06 19:05
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于第一天上午取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37℃培养箱培养12h。挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃， 250 rmin培养过夜。第二天上午取160 μl培养液转接至8 ml SPI培养基中，37℃，250 rmin培养至对数生长末期 (约4~5 h)，取0.2 ml培养液至2 ml SPII培养基中，37℃，100 rmin培养90 min ，加入20ul 10mmolL EGTA，再于37℃，100 rmin培养10分钟。分装成0.5 ml每管，各加入5ul DNA，再于37℃，250rmin培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。 试剂： SP盐：0.2%（NH4）2SO4, 1.4%K2HPO4, 0.6%KH2PO4, 0.02%MgSO4•7H2O, 0.1%柠檬酸钠； SPⅠ培养基：SP盐溶液加入1%体积浓度为50%葡萄糖溶液，1%体积100×CAYE溶液； SPⅡ培养基：SPⅠ培养基加入1%体积50mmol/LCaCl2溶液，1%体积250mmol/L MgCl2溶液。 SP－A Salts Solution：（500 ml Solution） 0.4％ (NH4)2SO4 2g 2.8% K2HPO4•3H2O 14g 1.2% KH2PO4 6g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g 121℃灭菌20min SP－B Salts Solution：（500 ml Solution） 0.04% MgSO4•7H2O 0.2g 121℃灭菌20min 100× CAYE Solution：（100 ml Solution） 2％ Casamino acid 2g 10％ Yeast Extract 10g 121℃灭菌20min SPI Medium：（20 mL） 9.8mL SP－A Salts Solution 9.8mL SP－B Salts Solution 200µL （1％V）Glucose（50％w/v，115℃灭菌20min） 200µL （1％V）100× CAYE SPII Medium：（6 mL） 5.88mL SPI Medium 60µL （1％V）50mM CaCl2 60µL （1％V）250mM MgCl2 100×EGTA Solution： 10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0 |
3楼2010-03-06 17:06:49