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微笑漩涡新虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】做过TAIL-PCR的大侠帮忙哈
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最近做兼并PCR获得一个约500bp的核酸片段，想通过TAIL-PCR获得全长。 但是不知道在这个PCR中 低退火温度的随机引物（AD）如何设计。 我的基因组是宏基因组，不能确定物种。 劳烦做过的大侠回答。谢谢 |
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2楼2010-03-06 09:52:58
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1949stone(金币+3): 2010-03-06 20:48
1949stone(金币+3): 2010-03-06 20:48
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不好意思，我误导你了，我做的时候就是用刘的那个随机引物，但是换其他物种不一定能够做出来， 可以根据已知序列设计3 个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物,特异性引物的长度约20 bp , Tm 一般为58～68 ℃。再按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物,简并引物相对较短,长度为14 bp , Tm 为30～48 ℃。 兼并引物你会设计吧，用你要扩增的物种的近缘物种的蛋白质序列进行blast，找出保守序列，用primer primer5.0把保守的氨基酸反过来翻译成核酸的兼并序列， 获得侧翼序列除了tail-PCR还有genome walking（就是酶切之后加接头的那种） |
3楼2010-03-06 20:35:32