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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】细菌三亲本杂交
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free-fish

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】细菌三亲本杂交

三亲本杂交做了两个月了，都没得到想要的目的菌，不知道三亲本杂交的关键是什么，是不是由于菌种的问题，请大家指点一下，谢谢！我的目的质粒在
DH5α里，辅助菌pRK2013...
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1楼 2010-03-04 12:51:25
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
free-fish(金币+2): 2010-03-04 13:59
关键在于三者的比例，还有就是你DH5α里面的质粒怎样了？慢慢做吧，我当时也是坐了好久才做出来的！
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2楼2010-03-04 13:56:59
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free-fish

铜虫 (正式写手)
但是老师教的时候只说供体和辅助菌多些，受体菌少量，我也没在意具体的比例，我主要尝试plate mating, 也有尝试eppendorf mating,这个的话就是三者等比例，微生物看不见摸不着，也不知道问题在哪里，郁闷哦
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3楼2010-03-04 14:03:40
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
free-fish(金币+1): 2010-03-04 14:24
能否详细介绍一下您遇到的问题？
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
4楼2010-03-04 14:08:12
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free-fish

铜虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励详细介绍。 2010-03-04 21:40
Plate mating
供体菌 培养12小时
辅助菌 培养12小时
受体菌 培养24小时（目的菌种需要培养这么长时间）
用手术刀刮取菌体（这个量不知道怎么描述，一般是尽可能多地把受体菌和辅助菌刮下来，因为大肠杆菌好像长得不疯狂，在平板上淡淡的），三种菌体各占一个点，然后用枪头把他们混匀，共培养48小时候转到筛选培养基中，长出来的单菌落用受体菌和供体质粒检测的两对引物去跑PCR，只有受体菌的引物嫩那个跑出带而供体菌的引物则没东西
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5楼2010-03-04 14:23:45
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free-fish

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2010-03-04 14:08:12:
能否详细介绍一下您遇到的问题？

已经回复了，您看看详细不？
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6楼2010-03-04 14:28:30
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★
amisking(金币+3): 2010-03-04 21:40
free-fish(金币+3): 2010-03-05 11:04
一般我们做的时候是3：3：1或者是1：1：1的比例，
1：先将三种菌分别药品培养至少12小时，菌长得越多越好； 待第二天去做三亲株，将过夜的菌液进行离心，取上清，最后去下面的菌体，称重（便于算比例）；
2：比例算号之后稀释，将三种菌液点到一个板子上，培养一天，刮取混菌体，然后稀释，涂布，等菌长出来后刮去单克隆进行扩大培养，然后提质粒，进行验证！
有时候做实验就是看运气！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2010-03-04 21:26:28
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
free-fish(金币+2): 2010-03-05 11:04
我用的方法跟楼上的基本是一样的，效率也不是很高，铺十几块板才能筛出几个，有时候做实验就是看运气！
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
8楼2010-03-05 08:30:45
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