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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒测序，公司说质量不好是怎么回事？
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 yujiaping1 的 2 个金币

yujiaping1

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】质粒测序，公司说质量不好是怎么回事？

我用top-10细胞克隆的3‘RACE产物，载体有PGEM-T easy和TOPO两种，酶切质粒检测，含有目的片段的，送公司测序，结果说质粒质量不好，只能单向测，双向测不了，单向的结果也很差，基本上都没有测到poly（A），不知道这是为什么，请高手指点！
而且测的也不对，连续核苷酸的情况挺多的，比对结果和相似性90%以上的物种，相似性只有70%，根本就是测的一塌糊涂，真是郁闷啊

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-2-2 at 18:47 ]
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1楼 2010-02-02 18:44:39
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雨中蜗牛

金虫 (正式写手)
★
yujiaping1(金币+1):谢谢参与 2010-02-02 19:29
1949stone(金币+1): 2010-02-13 18:14
是不是你质粒的信号低，你送的菌液是不是新鲜的啊？
有的公司测得也不准，有一次我在上海生工测得不行又改英骏测得，英俊的结果还行
不过我们这大部分在华大测，挺准的！
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■如果如果有一天?k忘記了沵爾一定要記得曾經有一個傻孩子?圻^爾
2楼2010-02-02 19:00:28
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yang0071

木虫 (职业作家)
yujiaping1(金币+1):谢谢参与 2010-02-02 19:29
目的片段gc含量高不？
高的话，要特别跟公司说明，他们会适当调整测序buffer的
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3楼2010-02-02 19:18:22
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 雨中蜗牛 at 2010-02-02 19:00:28:
是不是你质粒的信号低，你送的菌液是不是新鲜的啊？
有的公司测得也不准，有一次我在上海生工测得不行又改英骏测得，英俊的结果还行
不过我们这大部分在华大测，挺准的！

我送的不是菌液，是质粒啊
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4楼2010-02-02 19:28:19
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2010-02-02 19:18:22:
目的片段gc含量高不？
高的话，要特别跟公司说明，他们会适当调整测序buffer的

应该不高吧，我做RACE的时候就是用普通buffer的
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5楼2010-02-02 19:29:00
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jasco

木虫 (正式写手)
★
yujiaping1(金币+2):谢谢 2010-02-03 13:59
1949stone(金币+1): 2010-02-13 18:15
因为你做的3‘race，所以应该目的片段的3’端中含有polyA，如果你从polyA这头测，就会是一串T，会影响测序结果的，建议你从目的片段5‘端单向测，并且walking测到出现polyA序列或者告知测序公司可能会有polyA的影响，他们会调节反应体系解决的。
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6楼2010-02-03 13:04:21
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-02-03 13:04:21:
因为你做的3‘race，所以应该目的片段的3’端中含有polyA，如果你从polyA这头测，就会是一串T，会影响测序结果的，建议你从目的片段5‘端单向测，并且walking测到出现polyA序列或者告知测序公司可能会有polyA的影 ...

但是我这个是双向测的，公司说另一边根本就没法测
再说我是做了TA克隆的，polyA不是在中间嘛，应该没有影响了
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7楼2010-02-03 14:00:52
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jasco

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-02-03 14:00:52:

但是我这个是双向测的，公司说另一边根本就没法测
再说我是做了TA克隆的，polyA不是在中间嘛，应该没有影响了

肯定能测的，就是需要调整反应，

测序时候如果连续十几个T就会导致信号异常的，我测cDNA文库和race时候也遇到过类似问题，5‘端测正常的，3’端测就不行，但是测序公司调整反应后就测出来了
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8楼2010-02-03 14:14:15
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-02-03 14:14:15:


肯定能测的，就是需要调整反应，

测序时候如果连续十几个T就会导致信号异常的，我测cDNA文库和race时候也遇到过类似问题，5‘端测正常的，3’端测就不行，但是测序公司调整反应后就测出来了

韩国这边的公司测的结果都怪怪的，他们现在就说是我的样品有问题，我确信肯定质粒是没有问题的，用试剂盒回收的，酶切检测，亮度很好
而且他们测序的可信判读也很短，也就四五百，我都快被气死了
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9楼2010-02-03 14:46:12
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jasco

木虫 (正式写手)
yujiaping1(金币+1): 2010-02-03 15:46
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-02-03 14:46:12:

韩国这边的公司测的结果都怪怪的，他们现在就说是我的样品有问题，我确信肯定质粒是没有问题的，用试剂盒回收的，酶切检测，亮度很好
而且他们测序的可信判读也很短，也就四五百，我都快被气死了

晕，那你送菌液让他们提质粒试试看
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10楼2010-02-03 14:51:34
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