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【求助/交流】xbaI单酶切构建到pTMBV4上遇到的一些问题（急，在线等）
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如题，将我的目的片段构建到pTMBV4上，只有xbaI这一个酶切位点可以用。尝试了很多发生，有些问题不明白，想请教一下： 1：提起重组质粒做酶切后，为什么切下的条带大小不一致。 2：测序正确了两次，但我的目的片段都和载体连接反了。为什么反向连接比较容易？ 3：我接下来该怎么做？还是重新酶切在连接，挑菌测序，碰运气得到正向连接的吗？大家对于此有什么好的建议没有？ 整了好长时间了，单酶切，还是xbaI的单酶切。但是我想我能得到反向连接的，是不是可以说明xbaI这个酶对于大肠杆菌的DH5a菌株的甲基化作用，于我的载体构建失败上可以忽略？ |
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catherine_
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3楼2010-02-02 15:23:16
catherine_
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2楼2010-02-02 15:21:14
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amisking(金币+3): 2010-02-02 17:43
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l3labc(金币+1): 2010-02-02 20:59
l3labc(金币+1): 2010-02-02 21:01
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你说的“提起重组质粒做酶切后，为什么切下的条带大小不一致”，条带间有多大差异？ 我觉得不是反向的比较容易，这种连接应该是随机的，只是可能你选择的恰好是反向的。 我觉得目前只有两个办法：第一个，你多挑几个克隆去测序，看几率，这样费用比较贵，且存在风险；另一个是你是否可以选择载体上的两个不同的单酶切位点，然后将你的目的基因序列两端也分别设计相应的单酶切位点，这样连接时就可以按照你希望的方向连接好 我觉得你应该再好好分析一下你的载体序列单酶切位点和目的基因的酶切位点，重新选择一下，这样比较有把握。 希望你试验顺利！ |
4楼2010-02-02 15:40:27
5楼2010-02-02 16:21:41
