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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】xbaI单酶切构建到pTMBV4上遇到的一些问题（急，在线等）
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l3labc

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】xbaI单酶切构建到pTMBV4上遇到的一些问题（急，在线等）

如题，将我的目的片段构建到pTMBV4上，只有xbaI这一个酶切位点可以用。尝试了很多发生，有些问题不明白，想请教一下：
1：提起重组质粒做酶切后，为什么切下的条带大小不一致。
2：测序正确了两次，但我的目的片段都和载体连接反了。为什么反向连接比较容易？
3：我接下来该怎么做？还是重新酶切在连接，挑菌测序，碰运气得到正向连接的吗？大家对于此有什么好的建议没有？
整了好长时间了，单酶切，还是xbaI的单酶切。但是我想我能得到反向连接的，是不是可以说明xbaI这个酶对于大肠杆菌的DH5a菌株的甲基化作用，于我的载体构建失败上可以忽略？
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1楼 2010-02-02 15:16:48
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catherine_

木虫 (正式写手)
l3labc(金币+1): 2010-02-02 21:01
我觉得你真没必要重新酶切了，你就挑菌测序吧，我一般都是挑30个菌落，应该没问题的~！~
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2楼2010-02-02 15:21:14
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catherine_

木虫 (正式写手)
l3labc(金币+1): 2010-02-02 21:01
你叙述的我看不太明白，你说你要把目的片段构建到质粒上，质粒怎么只有一个位点呢？
你的意思是不是你的目的片段的两个端口是一致的？质粒单酶切之后，直接插入目的片段？

[ Last edited by catherine_ on 2010-2-2 at 15:28 ]
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3楼2010-02-02 15:23:16
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hpp509

银虫 (初入文坛)

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★ ★ ★
amisking(金币+3): 2010-02-02 17:43
l3labc(金币+1): 2010-02-02 20:59
l3labc(金币+1): 2010-02-02 21:01
你说的“提起重组质粒做酶切后，为什么切下的条带大小不一致”，条带间有多大差异？
我觉得不是反向的比较容易，这种连接应该是随机的，只是可能你选择的恰好是反向的。
我觉得目前只有两个办法：第一个，你多挑几个克隆去测序，看几率，这样费用比较贵，且存在风险；另一个是你是否可以选择载体上的两个不同的单酶切位点，然后将你的目的基因序列两端也分别设计相应的单酶切位点，这样连接时就可以按照你希望的方向连接好
我觉得你应该再好好分析一下你的载体序列单酶切位点和目的基因的酶切位点，重新选择一下，这样比较有把握。
希望你试验顺利！
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4楼2010-02-02 15:40:27
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
amisking(金币+3): 2010-02-02 17:43
l3labc(金币+3): 2010-02-02 20:57
l3labc(金币+2): 2010-02-02 21:01
菌落PCR时的引物采用

P1： 目的基因上游的载体通用引物
p2： 目的基因的反向引物。

能扩增出来的去测序。
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不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
5楼2010-02-02 16:21:41
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l3labc

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by l3labc at 2010-02-02 15:16:48:
如题，将我的目的片段构建到pTMBV4上，只有xbaI这一个酶切位点可以用。尝试了很多发生，有些问题不明白，想请教一下：
1：提起重组质粒做酶切后，为什么切下的条带大小不一致。
2：测序正确了两次，但我的目的片 ...

我也没有少挑菌。关键是菌落PCR是阳性的，而酶切却没有条带！
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6楼2010-02-02 17:57:00
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yang0071

木虫 (职业作家)
l3labc(金币+1): 2010-02-02 20:46
引用回帖:
Originally posted by l3labc at 2010-02-02 18:57:00:



我也没有少挑菌。关键是菌落PCR是阳性的，而酶切却没有条带！

没有条带是连载体条带也没有，还是说没有目的片段？
如果连载体条带也没有，说明你的质粒拷贝数太低
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7楼2010-02-02 19:15:55
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l3labc

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2010-02-02 19:15:55:


没有条带是连载体条带也没有，还是说没有目的片段？
如果连载体条带也没有，说明你的质粒拷贝数太低

没有。是没有酶切下我的目的片段。载体条带很亮的
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8楼2010-02-02 20:46:18
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l3labc

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 断弦的琴 at 2010-02-02 16:21:41:
菌落PCR时的引物采用

P1： 目的基因上游的载体通用引物
p2： 目的基因的反向引物。

能扩增出来的去测序。

哦  我今天下午试了试 明天出结果
谢谢哈
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9楼2010-02-02 20:56:35
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l3labc

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hpp509 at 2010-02-02 15:40:27:
你说的“提起重组质粒做酶切后，为什么切下的条带大小不一致”，条带间有多大差异？
我觉得不是反向的比较容易，这种连接应该是随机的，只是可能你选择的恰好是反向的。
我觉得目前只有两个办法：第一个，你多挑 ...

我想在用单酶切位点在连一次。实在不行，我在在我的酶切位点前后自己设计一段连载体。谢谢你的祝福哈
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10楼2010-02-02 20:58:55
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