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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】长片段基因在酵母中表达如何选择载体？
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xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】长片段基因在酵母中表达如何选择载体？

长6.8K左右的基因在酵母中表达应选择哪种酵母表达载体比较合适？我的基因要分泌表达，它在酵母表达菌株中有背景表达，所以载体上必须带有纯化标签。另外，请教各位高手，我是用染色体步移法一段一段把基因扩出来的，已完成测序，现在要一次性把6.8K的片段扩增出来，该如何做？困惑中，期待大家的建议……
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1楼 2010-01-30 17:52:28
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
6.8K太大，肯定不适合用酿酒酵母分泌表达了，用毕赤酵母的话，pPIC9K用于分泌表达的，可以参考下。
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Thank-you，so-blue.
2楼2010-02-02 08:55:54
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看楼主的意思要有纯化标签，应该是想分泌表达出来纯化，但真的太大了，即使用毕赤

pcr出6.8kb的片段倒不难，现在很多公司有扩长片段的高保真酶，优化好pcr条件，应该没有问题。实在不行就分两段扩出来再拼接
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3楼2010-02-02 09:30:35
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xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体？

我和老师讨论了下，他说不要局限于酵母表达，还可以查一下其它表达大片段的真核表达载体。我是第一次接触这方面，请大家多指点
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4楼2010-02-02 09:57:43
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xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体？

还有一个问题，我是从DNA 水平做起的，编码区域内有两内含子，如果再从
DNA水平开始，必需将内含子敲除掉；从cDNA水平做，6.8K的片段也很困难。不管怎样，只能摸索着做了。大家多给我点意见。
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5楼2010-02-02 10:10:06
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
从cDNA一次拿到6.8k可能性很小，建议分段进行（不管是从dna还是cDNA开始做）
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6楼2010-02-02 10:44:12
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xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体？

我刚开始是利用染色体步移法把片段一段一段扩出来了，已经把该基因的序列信息弄清楚了，现在就是要把全长片段扩增出来进行表达和功能验证。Jasco老师，根据你的建议我是不是应该使用重叠PCR的方法分几段扩再进行连接？
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7楼2010-02-02 11:42:57
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jasco

木虫 (正式写手)
★
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对的，用重叠pcr做拼接，注意去掉内含子序列，
不要称呼我老师啦，探讨中互相学习
原核表达肯定不行，酵母也危险
细胞表达能做出10kb以上基因的表达，但是表达量都很低，纯化难度很大。

一个建议：能否针对你这个基因某些表位做表达，而不是做全长基因表达？这个要看你研究的目的了
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8楼2010-02-02 14:09:01
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xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体？

我刚才跟老师说了，他说要做全长基因表达。因为我们最后的目的是要转化大豆，所以必须先验证克隆的基因是非表达，有功能，谢谢前辈指导，我只能一步一步摸索了。
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9楼2010-02-02 17:21:26
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