24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 454  |  回复: 8
当前主题已经存档。

xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】长片段基因在酵母中表达如何选择载体?

长6.8K左右的基因在酵母中表达应选择哪种酵母表达载体比较合适?我的基因要分泌表达,它在酵母表达菌株中有背景表达,所以载体上必须带有纯化标签。另外,请教各位高手,我是用染色体步移法一段一段把基因扩出来的,已完成测序,现在要一次性把6.8K的片段扩增出来,该如何做?困惑中,期待大家的建议……
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
6.8K太大,肯定不适合用酿酒酵母分泌表达了,用毕赤酵母的话,pPIC9K用于分泌表达的,可以参考下。
Thank-you,so-blue.
2楼2010-02-02 08:55:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
看楼主的意思要有纯化标签,应该是想分泌表达出来纯化,但真的太大了,即使用毕赤

pcr出6.8kb的片段倒不难,现在很多公司有扩长片段的高保真酶,优化好pcr条件,应该没有问题。实在不行就分两段扩出来再拼接
3楼2010-02-02 09:30:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体?

我和老师讨论了下,他说不要局限于酵母表达,还可以查一下其它表达大片段的真核表达载体。我是第一次接触这方面,请大家多指点
4楼2010-02-02 09:57:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体?

还有一个问题,我是从DNA 水平做起的,编码区域内有两内含子,如果再从
DNA水平开始,必需将内含子敲除掉;从cDNA水平做,6.8K的片段也很困难。不管怎样,只能摸索着做了。大家多给我点意见。
5楼2010-02-02 10:10:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
从cDNA一次拿到6.8k可能性很小,建议分段进行(不管是从dna还是cDNA开始做)
6楼2010-02-02 10:44:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体?

我刚开始是利用染色体步移法把片段一段一段扩出来了,已经把该基因的序列信息弄清楚了,现在就是要把全长片段扩增出来进行表达和功能验证。Jasco老师,根据你的建议我是不是应该使用重叠PCR的方法分几段扩再进行连接?
7楼2010-02-02 11:42:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
对的,用重叠pcr做拼接,注意去掉内含子序列,
不要称呼我老师啦,探讨中互相学习
原核表达肯定不行,酵母也危险
细胞表达能做出10kb以上基因的表达,但是表达量都很低,纯化难度很大。

一个建议:能否针对你这个基因某些表位做表达,而不是做全长基因表达?这个要看你研究的目的了
8楼2010-02-02 14:09:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaofang9826

铜虫 (初入文坛)

长片段基因在酵母中表达如何选择载体?

我刚才跟老师说了,他说要做全长基因表达。因为我们最后的目的是要转化大豆,所以必须先验证克隆的基因是非表达,有功能,谢谢前辈指导,我只能一步一步摸索了。
9楼2010-02-02 17:21:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xiaofang9826 的主题更新
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见