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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】二次PCR污染
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xrr1988

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】二次PCR污染

最近做二次PCR出现了严重的污染问题，就是把第一轮PCR产物作为第二次反应的模板用另外的引物再做一次PCR,没有加错东西 ，序列回来发现物种跑到其他的科去了。很烦这个事，请问大家有什么避免污染的建议或者经验么？
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1楼 2010-01-22 09:47:28
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1,VIP+0): 1-22 13:44
你把你的第一轮的pcr产物稀释成梯度做下一轮的模板，一般稀释100，1000倍看一看
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2楼2010-01-22 10:15:50
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xrr1988

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by tianpingpe at 2010-1-22 10:15:
你把你的第一轮的pcr产物稀释成梯度做下一轮的模板，一般稀释100，1000倍看一看

是根据电泳结果将第一轮产物进行稀释作为下轮的模板，扩出来了结果测序回来结果不对，不知道是哪个环节污染到了。二次的感觉特别易污染。第一轮产物的拷贝数太大了
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3楼2010-01-22 11:25:12
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amilie030312

金虫 (正式写手)
不一定是污染，如果是变的地方不是很多那有可是你RT或者PCR的时候用的酶保真性不高，导致序列在扩增的过程中产生了突变，导致最终克隆结果测序就是错误了几个位点的了。本身一个基因在不同的物种中差别不会太大的，尤其是相近的物种，可能同源性会达到95%以上。不知道是不是这种结果导致的，呵呵，我猜的，不确定。
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4楼2010-01-22 14:19:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有没有切过胶？如果有的话可能是切胶的时候污染了，毕竟都在这上面切。
用巢式应该会改善一些
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5楼2010-01-22 14:22:14
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yhyi1

新虫 (小有名气)

就是爱出事

这个就是爱出事
没办法
能换的都换
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6楼2010-01-22 14:50:33
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