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plantst5928

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[交流] 【求助/交流】脉冲电泳有谁跑过？

最近在分子克隆上看到一个技术叫脉冲电泳，意思就是用交替变换方向的电流来跑胶，它的作用基本是让大片段的DNA分离的更开一些。
本人绕有兴致的做了一个小实验，我虽然没有脉冲电泳仪，但是原理还是明白的。我可以让电场方向不变，而是让胶的放置方向定时改变，来达到同样的效果。

我的实验过程如下：
灌制一块1%的琼脂糖胶，从中间切开，分成2块胶
两个胶放在一个电泳槽中，一个是始终顺着电场方向跑，另一个是先与电场方向成顺时针45度角，之后是逆时针45度角跑。
两个胶都上DL15000作为样品
跑胶的时间是：先跑15min，然后将第二块胶转向，再跑15min。
最后将两块胶放在一起去照相。发现结果与分子克隆上的不大一样。
我的结果是：正常方向的胶比脉冲胶跑的更远，大分子DNA跑的更开！
请大家来分析一下为什么？？？是分子克隆错了？？？

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1楼2010-01-18 23:03:09

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1949stone

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1984年，Schwartz和Centor发明了交变脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)技术，与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。
一、PFGE的基本原理
脉冲电泳分离DNA大分子的介质是琼脂糖，大于20kb的线性DNA双链片段，在琼脂糖凝胶的网孔中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。普通的单方向恒定电场给DNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段的效果。
PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。在交变脉冲电场中，大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长，因为前者变形能力低于后者。当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，该DNA的迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大致成正比，PFGE也是基于不同DNA分子量的差异作为分离不同DNA分子的依据。当DNA分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNA分子量成反比。根据被分离DNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的DNA就被分离。DNA分子的净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔。
影响PFGE分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强PFGE对大小差异较大的DNA样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的DNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的DNA分子。