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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】普通PCR扩不出的菌在定量PCR时扩出来了，怎么解释？
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】普通PCR扩不出的菌在定量PCR时扩出来了，怎么解释？

我设计的特异性引物，先做了普通PCR进行了验证，目的菌能扩出来，用来做验证的非目的菌扩不出来，可是上定量了以后非目的菌也都扩出来了，而且熔解曲线跟目的菌的重合，Tm值也很接近，相差正负0.03以内，非目的菌的Ct值也不大，在18~30之间。目的菌的Ct值是14左右。
第一次做定量，很多问题都不懂，请大家帮帮忙！
谢谢！
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1楼 2010-01-12 19:52:42
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沙中清泉

木虫 (正式写手)
交叉污染了？
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2楼2010-01-12 21:47:36
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 沙中清泉 at 2010-1-12 21:47:
交叉污染了？

应该不是...
首先，所有用来做验证的都扩出来了
然后，我用现在正在使用的DNA测过序，测序结果证明这些菌都是各不相同的
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3楼2010-01-12 21:56:49
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zrb7858

至尊木虫 (著名写手)

片风
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
普通PCR应该也扩增除了，可能浓度低，看不到
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4楼2010-01-13 08:26:25
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hyde0706

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
实时灵敏度高啊！最低可以检测10个拷贝，普通PCR电泳检测肯定不行了。
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5楼2010-01-13 08:27:43
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zrb7858 at 2010-1-13 08:26:
普通PCR应该也扩增除了，可能浓度低，看不到

哦，我后来也怀疑是不是这样的
那用普通PCR鉴定特异性就没什么意义了吗？
要怎么办呢？
我最终是要上定量的
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6楼2010-01-13 11:10:57
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hyde0706 at 2010-1-13 08:27:
实时灵敏度高啊！最低可以检测10个拷贝，普通PCR电泳检测肯定不行了。

谢谢！
那我应该怎么办呢？
直接用定量PCR检测特异性吗？成本太高了
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7楼2010-01-13 11:12:05
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刘仕博

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也不是很懂，不过做了一些。我觉得如果非目的菌也做出来的话是不是这个引物就不能用了呀。
而且评我个人的经验，做一般的PCR对real time根本没有什么指导性的意义。虽然名字差不多，但是其实实验条件和目的好像差的还是挺多的。
不过real time的确贵，这个问题谁都解决不了，那就只能在找引物的时候小心点，尽量不浪费就好了。实验吗，总是要花银子的~
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生命在于折腾~
8楼2010-01-13 14:53:03
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wnhappy

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该是污染了，定量PCR的确是很贵啊，先用普通的多验证一下再上定量吧。
http://tong.dxy.cn/ff80808122078 ... nfo/1/all/index.htm
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9楼2010-01-13 15:43:32
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 刘仕博 at 2010-1-13 14:53:
我也不是很懂，不过做了一些。我觉得如果非目的菌也做出来的话是不是这个引物就不能用了呀。
而且评我个人的经验，做一般的PCR对real time根本没有什么指导性的意义。虽然名字差不多，但是其实实验条件和目的好像 ...

谢谢你的回复！
我之前用普通基因设计的引物，出现了这样的问题，后来用特异性引物设计了，还是这样，不知道怎么回事，可能就是我设计的引物不行吧，我是用primer5设计的，然后拿去BLAST，也没看到有我现在扩出来的这些菌啊，可还是扩出来了，不知道怎么做了，头疼
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10楼2010-01-13 19:17:17
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