Znn3bq.jpeg
查看: 595  |  回复: 9
当前主题已经存档。

小虫之老虫

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】普通PCR扩不出的菌在定量PCR时扩出来了,怎么解释?

我设计的特异性引物,先做了普通PCR进行了验证,目的菌能扩出来,用来做验证的非目的菌扩不出来,可是上定量了以后非目的菌也都扩出来了,而且熔解曲线跟目的菌的重合,Tm值也很接近,相差正负0.03以内,非目的菌的Ct值也不大,在18~30之间。目的菌的Ct值是14左右。
第一次做定量,很多问题都不懂,请大家帮帮忙!
谢谢!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沙中清泉

木虫 (正式写手)

交叉污染了?
2楼2010-01-12 21:47:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 沙中清泉 at 2010-1-12 21:47:
交叉污染了?

应该不是...
首先,所有用来做验证的都扩出来了
然后,我用现在正在使用的DNA测过序,测序结果证明这些菌都是各不相同的
3楼2010-01-12 21:56:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zrb7858

至尊木虫 (著名写手)

片风


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
普通PCR应该也扩增除了,可能浓度低,看不到
4楼2010-01-13 08:26:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyde0706

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
实时灵敏度高啊!最低可以检测10个拷贝,普通PCR电泳检测肯定不行了。
5楼2010-01-13 08:27:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by zrb7858 at 2010-1-13 08:26:
普通PCR应该也扩增除了,可能浓度低,看不到

哦,我后来也怀疑是不是这样的
那用普通PCR鉴定特异性就没什么意义了吗?
要怎么办呢?
我最终是要上定量的
6楼2010-01-13 11:10:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by hyde0706 at 2010-1-13 08:27:
实时灵敏度高啊!最低可以检测10个拷贝,普通PCR电泳检测肯定不行了。

谢谢!
那我应该怎么办呢?
直接用定量PCR检测特异性吗?成本太高了
7楼2010-01-13 11:12:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘仕博

金虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我也不是很懂,不过做了一些。我觉得如果非目的菌也做出来的话是不是这个引物就不能用了呀。
而且评我个人的经验,做一般的PCR对real time根本没有什么指导性的意义。虽然名字差不多,但是其实实验条件和目的好像差的还是挺多的。
不过real time的确贵,这个问题谁都解决不了,那就只能在找引物的时候小心点,尽量不浪费就好了。实验吗,总是要花银子的~
生命在于折腾~
8楼2010-01-13 14:53:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wnhappy


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
应该是污染了,定量PCR的确是很贵啊,先用普通的多验证一下再上定量吧。
http://tong.dxy.cn/ff80808122078 ... nfo/1/all/index.htm
9楼2010-01-13 15:43:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 刘仕博 at 2010-1-13 14:53:
我也不是很懂,不过做了一些。我觉得如果非目的菌也做出来的话是不是这个引物就不能用了呀。
而且评我个人的经验,做一般的PCR对real time根本没有什么指导性的意义。虽然名字差不多,但是其实实验条件和目的好像 ...

谢谢你的回复!
我之前用普通基因设计的引物,出现了这样的问题,后来用特异性引物设计了,还是这样,不知道怎么回事,可能就是我设计的引物不行吧,我是用primer5设计的,然后拿去BLAST,也没看到有我现在扩出来的这些菌啊,可还是扩出来了,不知道怎么做了,头疼
10楼2010-01-13 19:17:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小虫之老虫 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 农学0904 312求调剂 +3 Say Never 2026-04-11 3/150 2026-04-11 17:22 by daydayup2005
[考研] 352 求调剂 +6 yzion 2026-04-11 8/400 2026-04-11 16:24 by 明月此时有
[考研] 295求调剂 +3 桂秋二十八 2026-04-05 5/250 2026-04-11 11:36 by zhq0425
[考研] 一志愿211生物学280分 求调剂 +7 李rien 2026-04-05 7/350 2026-04-11 11:16 by 逆水乘风
[考研] 化工求调剂! +35 RichLi_ 2026-04-06 35/1750 2026-04-11 11:02 by zhq0425
[考研] 一志愿哈工大 085600 277 12材科基求调剂 5+5 chenny174 2026-04-10 23/1150 2026-04-11 10:43 by Delta2012
[考研] 283求调剂,工科! +12 苏打水7777 2026-04-08 12/600 2026-04-11 10:28 by 逆水乘风
[考研] 311求调剂 +13 xyp想读书 2026-04-10 14/700 2026-04-11 09:41 by 猪会飞
[考研] 282,求调剂 +12 jggshjkkm 2026-04-09 14/700 2026-04-11 09:39 by 猪会飞
[考研] 人工智能320调剂08工类还有机会吗 +11 振—TZ 2026-04-10 11/550 2026-04-10 21:51 by blankyung
[考研] 298求调剂 +13 钉叮咚冬瓜 2026-04-09 13/650 2026-04-10 15:49 by jiajinhpu
[考研] 生物学调剂,一志愿西南大学348,Top期刊一区二作、二区三作,三等奖学金三次 +4 candyyyi 2026-04-09 4/200 2026-04-09 18:39 by l_paradox
[考研] 一志愿厦大生物学332求调剂 +10 池池池池池池 2026-04-08 10/500 2026-04-09 17:10 by 独醉梦孤城
[考研] 一志愿鲁东大学071000生物学学硕初试分数276求调剂 +3 慕绝cc 2026-04-09 3/150 2026-04-09 09:57 by liuhuiying09
[考研] 一志愿0807 数一英一 313 有没有二轮调剂 +11 emokidd 2026-04-08 12/600 2026-04-09 09:24 by wyf236
[考研] 求助071001调剂!!! +7 黄守松 2026-04-05 8/400 2026-04-09 09:07 by 徐良白眉大侠
[考研] 307分材料专业求调剂 +12 Hll胡 2026-04-05 12/600 2026-04-08 16:33 by luoyongfeng
[考研] 材料科学与工程320求调剂,080500 +12 黄瓜味薯片 2026-04-06 12/600 2026-04-08 16:26 by luoyongfeng
[考研] 0857大类环境工程B区求调剂 +3 龚禹铭 2026-04-05 3/150 2026-04-06 10:22 by 蓝云思雨
[考研] 327求调剂 +4 拾光任染 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:16 by 南航~万老师
信息提示
请填处理意见