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小虫之老虫

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】普通PCR扩不出的菌在定量PCR时扩出来了,怎么解释?

我设计的特异性引物,先做了普通PCR进行了验证,目的菌能扩出来,用来做验证的非目的菌扩不出来,可是上定量了以后非目的菌也都扩出来了,而且熔解曲线跟目的菌的重合,Tm值也很接近,相差正负0.03以内,非目的菌的Ct值也不大,在18~30之间。目的菌的Ct值是14左右。
第一次做定量,很多问题都不懂,请大家帮帮忙!
谢谢!
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沙中清泉

木虫 (正式写手)

交叉污染了?
2楼2010-01-12 21:47:36
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 沙中清泉 at 2010-1-12 21:47:
交叉污染了?

应该不是...
首先,所有用来做验证的都扩出来了
然后,我用现在正在使用的DNA测过序,测序结果证明这些菌都是各不相同的
3楼2010-01-12 21:56:49
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zrb7858

至尊木虫 (著名写手)

片风


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
普通PCR应该也扩增除了,可能浓度低,看不到
4楼2010-01-13 08:26:25
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hyde0706

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
实时灵敏度高啊!最低可以检测10个拷贝,普通PCR电泳检测肯定不行了。
5楼2010-01-13 08:27:43
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by zrb7858 at 2010-1-13 08:26:
普通PCR应该也扩增除了,可能浓度低,看不到

哦,我后来也怀疑是不是这样的
那用普通PCR鉴定特异性就没什么意义了吗?
要怎么办呢?
我最终是要上定量的
6楼2010-01-13 11:10:57
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by hyde0706 at 2010-1-13 08:27:
实时灵敏度高啊!最低可以检测10个拷贝,普通PCR电泳检测肯定不行了。

谢谢!
那我应该怎么办呢?
直接用定量PCR检测特异性吗?成本太高了
7楼2010-01-13 11:12:05
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刘仕博

金虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我也不是很懂,不过做了一些。我觉得如果非目的菌也做出来的话是不是这个引物就不能用了呀。
而且评我个人的经验,做一般的PCR对real time根本没有什么指导性的意义。虽然名字差不多,但是其实实验条件和目的好像差的还是挺多的。
不过real time的确贵,这个问题谁都解决不了,那就只能在找引物的时候小心点,尽量不浪费就好了。实验吗,总是要花银子的~
生命在于折腾~
8楼2010-01-13 14:53:03
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wnhappy


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
应该是污染了,定量PCR的确是很贵啊,先用普通的多验证一下再上定量吧。
http://tong.dxy.cn/ff80808122078 ... nfo/1/all/index.htm
9楼2010-01-13 15:43:32
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小虫之老虫

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 刘仕博 at 2010-1-13 14:53:
我也不是很懂,不过做了一些。我觉得如果非目的菌也做出来的话是不是这个引物就不能用了呀。
而且评我个人的经验,做一般的PCR对real time根本没有什么指导性的意义。虽然名字差不多,但是其实实验条件和目的好像 ...

谢谢你的回复!
我之前用普通基因设计的引物,出现了这样的问题,后来用特异性引物设计了,还是这样,不知道怎么回事,可能就是我设计的引物不行吧,我是用primer5设计的,然后拿去BLAST,也没看到有我现在扩出来的这些菌啊,可还是扩出来了,不知道怎么做了,头疼
10楼2010-01-13 19:17:17
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