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[交流]
多蛋白复合体做X射线晶体衍射，敬请不吝赐教！
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| 假设蛋白A能与蛋白B在体外（In Vitro）相互作用形成2A4B的四级结构（即该结构由两个A与四个B组成）。A、B均为已知蛋白（假设分子量分别为10 kD、20 kD）。Pull-down后非变性凝胶电泳、SDS-PAGE显示蛋白A、B确实能相互结合形成复合物，但我如何才能证实复合物结构组成就是2A4B？我想做X射线晶体衍射测定复合物的空间结构，象这种多蛋白复合体做X-ray现实吗？可以的话具体如何做？敬请不吝赐教！ |
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xiaochong98
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huangxc8687(金币+1,VIP+0):谢谢参与！ 1-10 13:06
87328068(金币+8,VIP+0):谢谢你的回复！我要写个项目申请，其中就有X射线晶体衍射实验方案，我以前从没做过，你看这么写行吗？衷心感谢！①采用悬滴汽相扩散法培养晶体：将1 μl蛋白溶液（之前15000 rpm高速离心30 min，尽可能去除样品中的杂质，减少不必要的成核中心）和1 μl池液在硅化过的盖玻片上混合，倒扣于预先加入200 μl池液的晶体生长板的小孔上，小孔和盖玻片之间用真空脂密封，一定温度下静置；②初始结晶条件摸索采用Hampton Research公司生产的Crystallization Screening KitI和KitII结晶试剂盒，经过对温度、溶液pH、蛋白质浓度、离子强度、添加剂和沉淀剂等条件进一步优化，确定最佳结晶条件；③待晶体长出后，进行X射线衍射分析，晶体衍射数据用Mar-Research面探测器系统收集。数据收集在100 K低温冷冻条件下进行，防冻液为含有15％甘油的池液。数据收集前晶体在防冻液中浸泡5-10 s，然后迅速移到100 K的氮气流中，应用Oxford Cryosystem维持100 K的低温条件。衍射数据通过HKL2000程序包的Denzo/Scalepack程序进行处理；④解析结构（相位确定、电子密度图的解释和结构修正）。 1-10 17:03
huangxc8687(金币+1,VIP+0):谢谢参与！ 1-10 13:06
87328068(金币+8,VIP+0):谢谢你的回复！我要写个项目申请，其中就有X射线晶体衍射实验方案，我以前从没做过，你看这么写行吗？衷心感谢！①采用悬滴汽相扩散法培养晶体：将1 μl蛋白溶液（之前15000 rpm高速离心30 min，尽可能去除样品中的杂质，减少不必要的成核中心）和1 μl池液在硅化过的盖玻片上混合，倒扣于预先加入200 μl池液的晶体生长板的小孔上，小孔和盖玻片之间用真空脂密封，一定温度下静置；②初始结晶条件摸索采用Hampton Research公司生产的Crystallization Screening KitI和KitII结晶试剂盒，经过对温度、溶液pH、蛋白质浓度、离子强度、添加剂和沉淀剂等条件进一步优化，确定最佳结晶条件；③待晶体长出后，进行X射线衍射分析，晶体衍射数据用Mar-Research面探测器系统收集。数据收集在100 K低温冷冻条件下进行，防冻液为含有15％甘油的池液。数据收集前晶体在防冻液中浸泡5-10 s，然后迅速移到100 K的氮气流中，应用Oxford Cryosystem维持100 K的低温条件。衍射数据通过HKL2000程序包的Denzo/Scalepack程序进行处理；④解析结构（相位确定、电子密度图的解释和结构修正）。 1-10 17:03
| 应该没有问题，当前pdb蛋白库中有许多这样的结构。 |
2楼2010-01-10 12:15:14
3楼2010-01-10 18:38:00
