【求助/交流】引物的Tm值到底以哪个为准 - 分子生物 - 综合其他

11楼2010-01-12 21:50:23

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yujiaping1

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Originally posted by xiaorong-er at 2010-1-10 11:17:
RNA肯定是没有问题 ...

梯度退火温度总是能解决这个问题的，都是经验算法，不能说谁准谁不准，针对不同的引物，不同的方法会有效，都是估计值。如果觉得筛选温度费劲，不如touch down了

但是楼主有个问题要注意一下，内参能跑出来，证明RNA没有问题这是对的，但是并不代表这样你就能扩增出来，其中引物是一方面原因，目的基因的丰度又是另一个很重要的因素，有的时候扩增失败，是由于目的基因丰度太低造成的，所以还要注意提取RNA的组织，刺激目的基因表达等，另外直接增加RNA的用量都是有用的

12楼2010-01-13 14:10:22

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刘仕博

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我也遇见了这个问题，找了几个地方，几个地方都给的是不一样的Tm。
一般我就先做下温度梯度，直到现在我也说不出来哪个给的准~

生命在于折腾~

13楼2010-01-13 14:43:18

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xiaorong-er

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我又试了几对引物，还是扩增不出条带，到是内参条件怎么改都可以扩增很亮，我提的RNA比值1.8左右，有的还低于1.8，我就选的比较好的RNA进行cDNA后再进行PCR的。真不知道怎么办的好，眼看就要毕业了，急死了，公司说3000块钱可以给做，但是也不能保证能做出来，自己做了好几个月了，一直找不到合适的引物，真是没有办法支招了。

14楼2010-01-14 15:39:38

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linxi8579

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我怎么看众说纷纭啊，我用p5设计的引物退火温度与引物公司的也不一样，引物公司与用公式算出来的一样，我用的那个。并且我是好几对引物，用的touchdown.扩的效果还不错呢。

15楼2010-01-14 16:56:47

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gynan123

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我一般是按照引物报告单上加减3度，做梯度。你要不要把所有试剂都换新的试试，我有次怎么也扩不出来，后来换了试剂就好了

16楼2010-01-14 19:55:08

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xiaorong-er

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是新买的试剂，扩内参没有一点问题。我是通过几种动物比对后根据其中一种动物的mRNA来设计的引物，是不是这样不行？但是当初人家说没有问题的，我真的有点困惑了。

17楼2010-01-14 21:00:33

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yujiaping1

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Originally posted by xiaorong-er at 2010-1-14 21:00:
是新买的试剂，扩内参没有一点问题。我是通过几种动物比对后根据其中一种动物的mRNA来设计的引物，是不是这样不行？但是当初人家说没有问题的，我真的有点困惑了。

找最近缘的种设计引物，同源性最好在90%以上，否则最好比对基因组序列和蛋白质序列设计简并引物，注意简并度尽量不要高于16，用简并引物扩增的时候，引物用量要根据简并度适当增大

18楼2010-01-15 16:24:42

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xiaorong-er

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我不会做简并引物设计，哪位高手帮我设计几对呀？在下感激不尽。
我是要做鸟类的CSAD(半胱亚磺酸脱羧酶）基因表达，现在只能查到哺乳动物的基因序列。有一篇文章是做鸡的CSAD(半胱亚磺酸脱羧酶）基因表达的，我用它上面的引物也是扩增不出来，真是没有蛰了。