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沙中清泉

木虫 (正式写手)

引物合成单减五度
11楼2010-01-12 21:50:23
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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Originally posted by xiaorong-er at 2010-1-10 11:17:
RNA肯定是没有问题 ...

梯度退火温度总是能解决这个问题的,都是经验算法,不能说谁准谁不准,针对不同的引物,不同的方法会有效,都是估计值。如果觉得筛选温度费劲,不如touch down了

但是楼主有个问题要注意一下,内参能跑出来,证明RNA没有问题这是对的,但是并不代表这样你就能扩增出来,其中引物是一方面原因,目的基因的丰度又是另一个很重要的因素,有的时候扩增失败,是由于目的基因丰度太低造成的,所以还要注意提取RNA的组织,刺激目的基因表达等,另外直接增加RNA的用量都是有用的
12楼2010-01-13 14:10:22
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刘仕博

金虫 (著名写手)


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我也遇见了这个问题,找了几个地方,几个地方都给的是不一样的Tm。
一般我就先做下温度梯度,直到现在我也说不出来哪个给的准~
生命在于折腾~
13楼2010-01-13 14:43:18
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xiaorong-er

金虫 (正式写手)

我又试了几对引物,还是扩增不出条带,到是内参条件怎么改都可以扩增很亮,我提的RNA比值1.8左右,有的还低于1.8,我就选的比较好的RNA进行cDNA后再进行PCR的。真不知道怎么办的好,眼看就要毕业了,急死了,公司说3000块钱可以给做,但是也不能保证能做出来,自己做了好几个月了,一直找不到合适的引物,真是没有办法支招了。
14楼2010-01-14 15:39:38
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linxi8579

铜虫 (正式写手)


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我怎么看众说纷纭啊,我用p5设计的引物退火温度与引物公司的也不一样,引物公司与用公式算出来的一样,我用的那个。并且我是好几对引物,用的touchdown.扩的效果还不错呢。
15楼2010-01-14 16:56:47
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gynan123

金虫 (小有名气)


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我一般是按照引物报告单上加减3度,做梯度。你要不要把所有试剂都换新的试试,我有次怎么也扩不出来,后来换了试剂就好了
16楼2010-01-14 19:55:08
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xiaorong-er

金虫 (正式写手)

是新买的试剂,扩内参没有一点问题。我是通过几种动物比对后根据其中一种动物的mRNA来设计的引物,是不是这样不行?但是当初人家说没有问题的,我真的有点困惑了。
17楼2010-01-14 21:00:33
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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引用回帖:
Originally posted by xiaorong-er at 2010-1-14 21:00:
是新买的试剂,扩内参没有一点问题。我是通过几种动物比对后根据其中一种动物的mRNA来设计的引物,是不是这样不行?但是当初人家说没有问题的,我真的有点困惑了。

找最近缘的种设计引物,同源性最好在90%以上,否则最好比对基因组序列和蛋白质序列设计简并引物,注意简并度尽量不要高于16,用简并引物扩增的时候,引物用量要根据简并度适当增大
18楼2010-01-15 16:24:42
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xiaorong-er

金虫 (正式写手)

我不会做简并引物设计,哪位高手帮我设计几对呀?在下感激不尽。
我是要做鸟类的CSAD(半胱亚磺酸脱羧酶)基因表达,现在只能查到哺乳动物的基因序列。有一篇文章是做鸡的CSAD(半胱亚磺酸脱羧酶)基因表达的,我用它上面的引物也是扩增不出来,真是没有蛰了。
19楼2010-01-16 15:37:51
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