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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】土壤DNA做PCR
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feng509

金虫 (小有名气)
想问下楼主是用什么方法提取的啊？提取后的DNA量如何，然后有没有纯化？
阴性对照是？
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爱，起于微笑，浓于亲吻，逝于泪水
11楼2010-01-08 22:22:19
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g0079

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
参照Zhou的方法,并进行了改进:称0. 5 g土
样于2 ml离心管中, 加1. 3 ml提取液( 0. 1 mol
Tris, 0. 1 mol EDTA, 0. 1 mol磷酸缓冲液, 1. 5 mol
NaCl, 1%CTAB, pH8. 0)涡旋混匀后置于- 80℃冰
箱静止30 min (或液氮速冻5 min) ,取出于65℃水
浴融化, 反复冻融3 次; 加100 μl蛋白酶K ( 10
mg/ml) , 37℃摇床振荡30 min,加200 μl浓度为
20%的SDS, 65℃水浴2 h (期间每15～20 min轻轻
颠倒混匀) ,室温6 000 r /min离心10 min,收集上
清,尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质;
沉淀加0. 75 ml提取液和50μl 20% SDS,涡旋10 s,
65℃水浴10 min,室温6 000 r/min离心10 min,合
并上清; 上清中加0. 5 倍体积的聚已二醇8000
(50% PEG, 1. 5 mol NaCl) 混匀, 沉淀过夜; 6 000
r /min离心30 min,弃上清,沉淀加入0. 5 ml 1 ×TE
溶解;用等体积的氯仿∶异戊醇( 24 ∶1 )抽提, 4℃,
12 000 r /min离心20 min收集上清,重复一次; 用
0. 1 倍体积NaAc ( 3 mol/L )和0. 6 倍体积异丙醇
( - 20℃预冷)室温沉淀4 h, 4℃, 12 000 r /min离心
20 min弃上清;沉淀用70%乙醇洗涤, 4℃, 12 000
r /min离心20 min 弃上清,晾干; 加50 μl超纯水
溶解。
然后PCR
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12楼2010-01-25 15:07:42
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生物00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by feng509 at 2010-01-08 22:22:19:
想问下楼主是用什么方法提取的啊？提取后的DNA量如何，然后有没有纯化？
阴性对照是？

试剂盒提的DNA不加BSA我也P出来了，现在是普通组的P不出来。我用的方法是
参照Zhou的方法,并进行了改进:称0. 5 g土
样于2 ml离心管中, 加1. 3 ml提取液( 0. 1 mol
Tris, 0. 1 mol EDTA, 0. 1 mol磷酸缓冲液, 1. 5 mol
NaCl, 1%CTAB, pH8. 0)涡旋混匀后置于- 80℃冰
箱静止30 min (或液氮速冻5 min) ,取出于65℃水
浴融化, 反复冻融3 次; 加100 μl蛋白酶K ( 10
mg/ml) , 37℃摇床振荡30 min,加200 μl浓度为
20%的SDS, 65℃水浴2 h (期间每15～20 min轻轻
颠倒混匀) ,室温6 000 r /min离心10 min,收集上
清,尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质;
沉淀加0. 75 ml提取液和50μl 20% SDS,涡旋10 s,
65℃水浴10 min,室温6 000 r/min离心10 min,合
并上清; 上清中加0. 5 倍体积的聚已二醇8000
(50% PEG, 1. 5 mol NaCl) 混匀, 沉淀过夜; 6 000
r /min离心30 min,弃上清,沉淀加入0. 5 ml 1 ×TE
溶解;用等体积的氯仿∶异戊醇( 24 ∶1 )抽提, 4℃,
12 000 r /min离心20 min收集上清,重复一次; 用
0. 1 倍体积NaAc ( 3 mol/L )和0. 6 倍体积异丙醇
( - 20℃预冷)室温沉淀4 h, 4℃, 12 000 r /min离心
20 min弃上清;沉淀用70%乙醇洗涤, 4℃, 12 000
r /min离心20 min 弃上清,晾干; 加50 μl超纯水
溶解。然后PCR,阴性对照是纯水。
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13楼2010-01-25 15:17:05
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
纯化一下DNA，将DNA适当稀释，提高Mg离子浓度,同时也要注意PCR偏好性问题。我们也用上述方法提DNA，扩增没问题。
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14楼2010-01-25 20:08:58
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