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【求助/交流】土壤DNA做PCR
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| 我分别用普通方法和试剂盒提出DNA，没有纯化进行PCR.如果不加BSA全都P不出来，加了BSA后，用试剂盒提出的DNA能P出500bp的片段，普通方法的P不出来，但同时阴性对照也有500bp的带。我知道出阴性的原因是BSA带菌，但是为什么阴性都出了反而普通方法的P不出来呢？ |
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试剂盒提的DNA不加BSA我也P出来了，现在是普通组的P不出来。我用的方法是 参照Zhou的方法,并进行了改进:称0. 5 g土 样于2 ml离心管中, 加1. 3 ml提取液( 0. 1 mol Tris, 0. 1 mol EDTA, 0. 1 mol磷酸缓冲液, 1. 5 mol NaCl, 1%CTAB, pH8. 0)涡旋混匀后置于- 80℃冰 箱静止30 min (或液氮速冻5 min) ,取出于65℃水 浴融化, 反复冻融3 次; 加100 μl蛋白酶K ( 10 mg/ml) , 37℃摇床振荡30 min,加200 μl浓度为 20%的SDS, 65℃水浴2 h (期间每15～20 min轻轻 颠倒混匀) ,室温6 000 r /min离心10 min,收集上 清,尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质; 沉淀加0. 75 ml提取液和50μl 20% SDS,涡旋10 s, 65℃水浴10 min,室温6 000 r/min离心10 min,合 并上清; 上清中加0. 5 倍体积的聚已二醇8000 (50% PEG, 1. 5 mol NaCl) 混匀, 沉淀过夜; 6 000 r /min离心30 min,弃上清,沉淀加入0. 5 ml 1 ×TE 溶解;用等体积的氯仿∶异戊醇( 24 ∶1 )抽提, 4℃, 12 000 r /min离心20 min收集上清,重复一次; 用 0. 1 倍体积NaAc ( 3 mol/L )和0. 6 倍体积异丙醇 ( - 20℃预冷)室温沉淀4 h, 4℃, 12 000 r /min离心 20 min弃上清;沉淀用70%乙醇洗涤, 4℃, 12 000 r /min离心20 min 弃上清,晾干; 加50 μl超纯水 溶解。然后PCR,阴性对照是纯水。 |
13楼2010-01-25 15:17:05
2楼2010-01-08 17:54:14
3楼2010-01-08 18:09:29
4楼2010-01-08 18:10:35
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