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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】细胞TEM制备中遇到的问题
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fyw921

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】细胞TEM制备中遇到的问题

TEM样品制备观察时细胞全部裂解，只能看到细胞核与离散的细胞器，请大家帮忙分析一下是什么原因使细胞裂解了
谢谢！
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1楼 2010-01-07 16:54:07
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mever

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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amisking(金币+5,VIP+0): 1-7 18:09
楼主最好把你的操作步骤讲一下 也方便找出问题
细胞破裂的原因很多
我估计你可能是在样品固定或者样品脱水环节出了问题
固定过程切记要用等渗缓冲液来溶解固定剂
细胞脱水过程的时间一定要够长 每一步脱水操作都要柔和
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2楼2010-01-07 17:49:02
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+4,VIP+0):谢谢交流 1-7 19:12
如果是动物细胞，问题应该主要出在前固定阶段。离心收集细胞时注意转速不能太高。动物细胞应该是最好做的电镜样品了。一般只要戊二醛固定过夜细胞就会硬化成块，饿酸后固定后会进一步硬化，后面就很好做了。如果没有成团就比较麻烦，可能要多次温和离心或者用明胶预包埋。

总是希望楼主能把样品特性以及制样过程详细说一下，不要只是一句话，让我们海阔天空的去想。
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3楼2010-01-07 19:02:13
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fyw921

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by mever at 2010-1-7 17:49:
楼主最好把你的操作步骤讲一下 也方便找出问题
细胞破裂的原因很多
我估计你可能是在样品固定或者样品脱水环节出了问题
固定过程切记要用等渗缓冲液来溶解固定剂
细胞脱水过程的时间一定要够长 每一步脱水操 ...

TEM超薄切片制样用PBS（0.2 mol/L）：甲液：0.2 mol/L的磷酸氢
钠溶液： Na2HPO4·12H2O 71.64 g加超纯水溶解并定容至 1000 mL；乙液： 0.2 mo磷酸二氢钠溶液：NaH2PO4·2H2O 31.21 g加超纯水溶解并定容至 1000 mL；甲乙液按 81 : 19 比例混合即得pH值为 7.4 的 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液。清洗固的细胞时用超纯水 1 : 1稀释。
8%多聚甲醛（paraformaldehyde, PFM）：称取 4 g多聚甲醛溶于 45
蒸馏水（ddH2O）中，加热至 60 oC，边搅拌边滴加1 mol/L的氢氧化钠溶液直
多聚甲醛彻底溶解，盐酸调节pH值为 7.2，定容至 50 mL，4 oC避光储存。 2.5%戊二醛固定液：取上述0.2 mol/L的PBS 50 mL，8% PFM 25 m
25%的戊二醛10 mL，混合后加ddH2O定容至 100 mL，4 oC避光储存。
细胞生长至80%，PBS清洗细胞3 次，用细胞刮轻
下细胞，移至eppendoff离心管中，1500 rpm离心 10min，由于离心过程中细胞没离下来重复三次，针头注射器沿管壁吸去上清液。 前固定：立即用吸管将 4 ℃预冷的 2.5%戊二醛固定液沿管壁千万不可将细胞团打散，于 4℃冰箱内固定 4 h。 以后步骤由专门的电镜老师操作，出问题可能在我自己操作的以上两步
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4楼2010-01-08 09:26:02
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
从步骤上看没什么问题，楼主的细胞要用那么高转速离那么久才能沉淀下来吗？我看过也有文章是室温固定一小时然后4度过夜，不过这个无关痛痒。

也可能是制样老师的问题，如果可以的话自己去做吧，放心点。
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5楼2010-01-08 13:28:30
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mever

木虫 (正式写手)
★
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我也认为你的固定操作没什么问题
很可能是电镜老师的操作出了问题
毕竟电镜的树脂包埋和超薄切片谁都不可能每次操作都不出问题的
建议你找电镜老师谈一下
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6楼2010-01-08 18:04:24
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