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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR扩增求救
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sdspring

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PCR扩增求救

需用Pfu酶从基因组扩增2kb，

反应体系：

Template <0.5μg，
Primer1(10μM) 0.5μl
Primer2(10μM) 0.5μl
Buffer 2.5μl
dNTP 2μl
酶 0.3μl
ddH2O 补至25μl


扩增条件：

95℃ 3min

95℃ 30sec
60-64℃ 30sec
72℃ 2min-4min
30个循环

72℃ 10min


产物中有一串连续的10个g


一直扩不出来，请高手赐教！
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1楼 2010-01-05 09:43:49
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sdspring

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-1-5 10:35:
1.一连串10个G不会影响的，除非整个基因序列GC含量高（加GCbuffer）
2.退火温度是这么高么，根据引物设置，或者touchdown
3.延伸温度，很多pfu最佳延伸温度为68度，
4.延伸效率，一般酶都能做到1kb/min，所以2 ...

谢谢！

整个引物的退火温度是 74.2度，74.4度；
除去酶切位点及保护碱基后的退火温度是 59.1度，60.8度。

Pfu酶的扩增效率不是才600bp/min吗？2min是不是有点短？
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13楼2010-01-06 11:10:12
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ln0401

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.buffer是否与pfu酶配套
2.建议用保真性好的taq或是taq与pfu混合使用
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2楼2010-01-05 10:03:21
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小小豆豆

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dntp的浓度是多少，一般用混合dntp时，加的量都较少，2微升太多了吧
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-01-05 10:28:40
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.检查你的模板有问题没有
2，引物设计是否合理
3.有没有阴性对照，如果有阳性对照更好，保证你的扩增体系没有问题
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-01-05 10:30:17
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