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sdspring

金虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PCR扩增求救

需用Pfu酶从基因组扩增2kb,

反应体系:

Template <0.5μg,
Primer1(10μM) 0.5μl
Primer2(10μM) 0.5μl
Buffer 2.5μl
dNTP 2μl
酶 0.3μl
ddH2O 补至25μl


扩增条件:

95℃ 3min

95℃ 30sec
60-64℃ 30sec
72℃ 2min-4min
30个循环

72℃ 10min


产物中有一串连续的10个g


一直扩不出来,请高手赐教!
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sdspring

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-1-5 10:35:
1.一连串10个G不会影响的,除非整个基因序列GC含量高(加GCbuffer)
2.退火温度是这么高么,根据引物设置,或者touchdown
3.延伸温度,很多pfu最佳延伸温度为68度,
4.延伸效率,一般酶都能做到1kb/min,所以2 ...

谢谢!

整个引物的退火温度是 74.2度,74.4度;
除去酶切位点及保护碱基后的退火温度是 59.1度,60.8度。

Pfu酶的扩增效率不是才600bp/min吗?2min是不是有点短?
13楼2010-01-06 11:10:12
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查看全部 27 个回答

ln0401

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1.buffer是否与pfu酶配套
2.建议用保真性好的taq或是taq与pfu混合使用
2楼2010-01-05 10:03:21
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小小豆豆

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dntp的浓度是多少,一般用混合dntp时,加的量都较少,2微升太多了吧
3楼2010-01-05 10:28:40
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tianpingpe

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1.检查你的模板有问题没有
2,引物设计是否合理
3.有没有阴性对照,如果有阳性对照更好,保证你的扩增体系没有问题
4楼2010-01-05 10:30:17
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