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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】GST标签蛋白纯化的问题
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】GST标签蛋白纯化的问题

本人最近在纯化一个蛋白（62kd），要求蛋白有活性，先将目的蛋白的基因连到了Pgex5-1的载体上，带GST纯化标签的载体，小量诱导成功，在大量收菌后，发现蛋白是在沉淀包涵体中的，着实郁闷了，不过还是按照分子克隆上的溶解包涵体的步骤将蛋白变成可溶的了。问题是在过GST的柱子之后跑胶发现蛋白基本上就没纯化到。刚开始以为是过柱子流速太快可能没挂住，之后将速度减低很多，结果还是不理想，我同时做的另一个蛋白（35kd）也是同样的方法纯化的就很好，重复做了几次都是这样，我很纳闷为什么这个蛋白就是纯化不到。各位高手指点一下吧！
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1楼 2010-01-02 22:29:39
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
我也认为是GST的结构被破坏了，导致不能有效地挂住。我已经尝试了低温诱导，但是还是在沉淀中。那么怎么才能有效地防止GST变性呢？
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5楼2010-01-04 23:31:42
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)

Always Keep The Faith！
★
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我从来不做包涵体，条件太剧烈了，蛋白重溶也有可能导致错误折叠吧。
有没试过诱导温度和养菌时间啊。

蛋白纯化就是这么freaky。wish u good luck~
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物必先腐而后虫生
2楼2010-01-03 12:28:41
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这是 经常性的情况，尤其是原核表达真核蛋白。
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3楼2010-01-04 11:59:58
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议先复性再上柱试试看，应该是GST构象变化导致不挂柱
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4楼2010-01-04 15:00:06
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