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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】GST标签蛋白纯化的问题
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】GST标签蛋白纯化的问题

本人最近在纯化一个蛋白（62kd），要求蛋白有活性，先将目的蛋白的基因连到了Pgex5-1的载体上，带GST纯化标签的载体，小量诱导成功，在大量收菌后，发现蛋白是在沉淀包涵体中的，着实郁闷了，不过还是按照分子克隆上的溶解包涵体的步骤将蛋白变成可溶的了。问题是在过GST的柱子之后跑胶发现蛋白基本上就没纯化到。刚开始以为是过柱子流速太快可能没挂住，之后将速度减低很多，结果还是不理想，我同时做的另一个蛋白（35kd）也是同样的方法纯化的就很好，重复做了几次都是这样，我很纳闷为什么这个蛋白就是纯化不到。各位高手指点一下吧！
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1楼 2010-01-02 22:29:39
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)

Always Keep The Faith！
★
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我从来不做包涵体，条件太剧烈了，蛋白重溶也有可能导致错误折叠吧。
有没试过诱导温度和养菌时间啊。

蛋白纯化就是这么freaky。wish u good luck~
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物必先腐而后虫生
2楼2010-01-03 12:28:41
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
★
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这是 经常性的情况，尤其是原核表达真核蛋白。
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3楼2010-01-04 11:59:58
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jasco

木虫 (正式写手)
★
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建议先复性再上柱试试看，应该是GST构象变化导致不挂柱
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4楼2010-01-04 15:00:06
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
我也认为是GST的结构被破坏了，导致不能有效地挂住。我已经尝试了低温诱导，但是还是在沉淀中。那么怎么才能有效地防止GST变性呢？
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5楼2010-01-04 23:31:42
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恒星年

银虫 (正式写手)
★
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建议优化诱导表达条件，尽量使蛋白是可溶性表达，包涵体复性后折叠很可能会变化，GST和目的蛋白都可能不能正确复性，很可能不能纯化，就算纯化到了，目的蛋白的活性也会受到很大的影响
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6楼2010-01-05 08:54:24
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刘超_2009

新虫 (小有名气)
★
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顶，小弟长见识了。弱问一下，构建表达载体以及优化表达条件时，怎样才能确保蛋白的可溶性表达呢？谢谢
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7楼2010-01-05 10:36:41
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
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GST蛋白表达就是要可溶性表达，如果是包涵体，那这次表达就是失败的。
需要优化表达条件。
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生物资源交流QQ群：1044518333
8楼2010-01-05 10:44:15
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