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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】载体构建过程中的酶连问题
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lfgc8505

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】载体构建过程中的酶连问题

请问各位虫友们在构建表达载体的过程中，酶连时有没有出现过酶连失败的情况。
小虫，最近在做表达载体构建，需要将酶切后的载体与目的基因连接起来，再转化，但是就是长不出来克隆。转化应该没问题，因为我每次做阳性对照都能长出很多。载体自连的背景对照也做了，也没长出来。
载体 目的基因比例也做了1比3 、1比5、1比10的。也加大酶量了，20微升体系加2微升的酶，对了我的酶是NEB的T4连接酶。也试过formentas的。都不行。很郁闷，所以想请问各路虫友们给支支招！
本人不胜感激！
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1楼 2009-12-30 23:55:37
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zhengxf415

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
检查一下载体本身以及酶切是否有问题，另外你的目的基因有多大？
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2楼2009-12-31 00:57:22
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
个人觉得比例比较重要~不是越多愈好~
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3楼2009-12-31 08:11:56
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yoyoyehan

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也遇到过这样的问题，后来改用clontech的infusion连接，还挺好用的，你可以试一试，祝好。
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4楼2009-12-31 08:46:01
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故乡的云

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶切的效率不高吧，看看你酶切后的回收效率，是不是回收的盒子出了问题。
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5楼2009-12-31 08:47:44
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lfgc8505

金虫 (小有名气)

载体本身应该没问题吧，我的目的基因只有170bp

引用回帖:
Originally posted by zhengxf415 at 2009-12-31 00:57:
检查一下载体本身以及酶切是否有问题，另外你的目的基因有多大？

载体本身应该没问题吧，酶切应该也没问题吧，我的目的基因只有170bp
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6楼2009-12-31 23:39:07
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lfgc8505

金虫 (小有名气)

请问那个公司就叫clontech么?

引用回帖:
Originally posted by yoyoyehan at 2009-12-31 08:46:
我也遇到过这样的问题，后来改用clontech的infusion连接，还挺好用的，你可以试一试，祝好。

请问那个公司就叫clontech么?直接在载体目的基因都切了以后直接加那玩意就可以了？
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7楼2009-12-31 23:40:55
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lfgc8505

金虫 (小有名气)

回收的效率是不是很高，但是也估计有三四十纳克吧，应该 够了吧

引用回帖:
Originally posted by 故乡的云 at 2009-12-31 08:47:
酶切的效率不高吧，看看你酶切后的回收效率，是不是回收的盒子出了问题。

回收的效率是不是很高，但是也估计有三四十纳克吧，应该 够了吧
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8楼2009-12-31 23:41:51
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Temin2009

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你连接的温度是多少度，我曾经有过4度过夜连接、室温放置3小时连接都失败，然后16度连接过夜就成功了的。
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9楼2010-01-01 00:00:22
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lfgc8505

金虫 (小有名气)

我的连接温度一般都是16度。

引用回帖:
Originally posted by Temin2009 at 2010-1-1 00:00:
你连接的温度是多少度，我曾经有过4度过夜连接、室温放置3小时连接都失败，然后16度连接过夜就成功了的。

我的连接温度一般都是16度。16度2小时，16度，三小时，16度5小时都做过。都不行。
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10楼2010-01-01 11:10:00
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