应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】载体构建过程中的酶连问题
121/2返回列表12下一页
查看: 995  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

lfgc8505

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】载体构建过程中的酶连问题

请问各位虫友们在构建表达载体的过程中，酶连时有没有出现过酶连失败的情况。
小虫，最近在做表达载体构建，需要将酶切后的载体与目的基因连接起来，再转化，但是就是长不出来克隆。转化应该没问题，因为我每次做阳性对照都能长出很多。载体自连的背景对照也做了，也没长出来。
载体 目的基因比例也做了1比3 、1比5、1比10的。也加大酶量了，20微升体系加2微升的酶，对了我的酶是NEB的T4连接酶。也试过formentas的。都不行。很郁闷，所以想请问各路虫友们给支支招！
本人不胜感激！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-12-30 23:55:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhengxf415

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
检查一下载体本身以及酶切是否有问题，另外你的目的基因有多大？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2009-12-31 00:57:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
个人觉得比例比较重要~不是越多愈好~
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2009-12-31 08:11:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yoyoyehan

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也遇到过这样的问题，后来改用clontech的infusion连接，还挺好用的，你可以试一试，祝好。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2009-12-31 08:46:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

故乡的云

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶切的效率不高吧，看看你酶切后的回收效率，是不是回收的盒子出了问题。
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2009-12-31 08:47:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lfgc8505

金虫 (小有名气)

载体本身应该没问题吧，我的目的基因只有170bp

引用回帖:
Originally posted by zhengxf415 at 2009-12-31 00:57:
检查一下载体本身以及酶切是否有问题，另外你的目的基因有多大？

载体本身应该没问题吧，酶切应该也没问题吧，我的目的基因只有170bp
赞一下 回复此楼
6楼2009-12-31 23:39:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lfgc8505

金虫 (小有名气)

请问那个公司就叫clontech么?

引用回帖:
Originally posted by yoyoyehan at 2009-12-31 08:46:
我也遇到过这样的问题，后来改用clontech的infusion连接，还挺好用的，你可以试一试，祝好。

请问那个公司就叫clontech么?直接在载体目的基因都切了以后直接加那玩意就可以了？
赞一下 回复此楼
7楼2009-12-31 23:40:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lfgc8505

金虫 (小有名气)

回收的效率是不是很高，但是也估计有三四十纳克吧，应该 够了吧

引用回帖:
Originally posted by 故乡的云 at 2009-12-31 08:47:
酶切的效率不高吧，看看你酶切后的回收效率，是不是回收的盒子出了问题。

回收的效率是不是很高，但是也估计有三四十纳克吧，应该 够了吧
赞一下 回复此楼
8楼2009-12-31 23:41:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Temin2009

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你连接的温度是多少度，我曾经有过4度过夜连接、室温放置3小时连接都失败，然后16度连接过夜就成功了的。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2010-01-01 00:00:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lfgc8505

金虫 (小有名气)

我的连接温度一般都是16度。

引用回帖:
Originally posted by Temin2009 at 2010-1-1 00:00:
你连接的温度是多少度，我曾经有过4度过夜连接、室温放置3小时连接都失败，然后16度连接过夜就成功了的。

我的连接温度一般都是16度。16度2小时，16度，三小时，16度5小时都做过。都不行。
赞一下 回复此楼
10楼2010-01-01 11:10:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lfgc8505 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿新疆大学085401，314分 +4 咔咔咔咔9 2026-04-05 4/200 2026-04-12 02:21 by 秋豆菜芽
[考研] 280求调剂 +7 兮兮夜夜 2026-04-09 10/500 2026-04-12 00:33 by 蓝云思雨
[考研] 296求调剂 +8 汪！？！ 2026-04-09 8/400 2026-04-11 21:02 by 逆水乘风
[考研] 303求调剂 +14 SereinQ 2026-04-10 15/750 2026-04-11 20:43 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂，一志愿大连理工大学354分 +5 雨声余生 2026-04-11 6/300 2026-04-11 16:12 by 雨声余生
[考研] 296求调剂 +13 汪！？！ 2026-04-10 15/750 2026-04-11 10:31 by 逆水乘风
[考研] 080100力学316求调剂 +8 L_Hairui 2026-04-07 8/400 2026-04-11 10:00 by zhq0425
[考研] 中药学调剂 初试324 +4 洋甘菊、 2026-04-10 6/300 2026-04-11 09:41 by gong120082
[考研] 085402通信工程调剂，有4项学科竞赛国奖（电赛国二），硕士研究生调剂自荐信。 +5 m永o不v言o弃m 2026-04-09 5/250 2026-04-11 09:33 by zhq0425
[考研] 0854调剂 +4 长弓傲 2026-04-09 4/200 2026-04-11 09:18 by 猪会飞
[考研] 调剂 +19 小张ZA 2026-04-10 20/1000 2026-04-10 22:08 by 猪会飞
[考研] 本9 一志愿西工大085601 324求调剂 +5 wysyjs25 2026-04-10 5/250 2026-04-10 16:57 by luoyongfeng
[考研] 一志愿京区985，085401电子信息，本科电子信息 +3 阳光开朗的男孩 2026-04-10 3/150 2026-04-10 16:29 by sophia_93
[考研] 环境专硕调剂 +16 会说话的肘子 2026-04-06 16/800 2026-04-10 10:30 by asy1wn
[考研] 1U盾记得记得就 +9 sanjin020722 2026-04-08 10/500 2026-04-09 14:11 by 诗与自由
[考研] 一志愿华南师范大学0702物理学305调剂 +4 念常安 2026-04-07 6/300 2026-04-08 22:53 by bljnqdcc
[考研] 298求调剂 +4 manman511 2026-04-05 4/200 2026-04-08 16:50 by tjzhao
[考研] 307分材料专业求调剂 +12 Hll胡 2026-04-05 12/600 2026-04-08 16:33 by luoyongfeng
[考研] 305求调剂 +4 77Qi 2026-04-06 4/200 2026-04-07 20:06 by shanqishi
[考研] 319分085702安全工程求调剂 +6 rious 2026-04-05 6/300 2026-04-07 09:42 by jp9609
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭